胃癌突變基因與患者預后及免疫功能的相關性

曾周 龔拯 劉麗麗 柯丁心 王斌， 張萬明，

(1 青島大學基礎醫學院，山東 青島 266071； 2 青島大學華賽醫學細胞和蛋白質藥物研究院)

胃癌是目前癌癥相關死亡的第三大原因，2020年全球新增胃癌病例超過100萬[1]。由于傳統治療手段(如手術、放療和化療)在晚期胃癌患者中的治療效果不佳，因此迫切需要新的治療方式。近年來，免疫治療顯著改善了胃癌患者的預后[2-3]，但也只有少部分患者能夠從中受益[4]。研究發現黑色素瘤、胃癌和非小細胞肺癌患者的腫瘤突變負荷(TMB)與免疫治療反應性及更好的預后相關[5-7]。而胃癌某些基因突變與患者預后的相關性尚不清楚。因此，需要了解更多胃癌基因突變對患者預后的影響。本研究從TCGA和ICGC數據庫中下載胃癌患者的體細胞突變基因，通過R軟件篩選出與患者生存率和預后密切相關的共同高頻突變基因，然后使用GSEA軟件進行基因富集分析，運用CIBERSORT算法計算腫瘤浸潤免疫細胞(TIICs)的相對豐度，探究共同高頻突變基因對患者TIICs的影響，旨在為胃癌患者的免疫治療提供理論和數據參考。現將結果報告如下。

1 資料和方法

1.1 資料來源

從TCGA數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov)中下載433例胃癌患者的體細胞基因突變數據及其臨床信息，時間截至2020年11月20日。排除某些臨床信息缺失者，最后389例胃癌患者納入本研究。從ICGC數據庫(http://dcc.icgc.org/releases/current/Projects) 中下載523例胃癌患者的體細胞基因突變數據。

1.2 高頻突變基因的篩選及其與患者預后和TMB的相關性分析

通過R軟件分析TCGA和ICGC數據庫中胃癌患者的體細胞突變數據[8]，對兩個數據庫中突變頻率位于前30位的基因取交集，獲得共同高頻突變基因，通過R軟件對共同高頻突變基因與患者預后的相關性進行Kaplan-Meier生存分析和Cox風險回歸分析，獲得與患者預后密切相關的突變基因。通過蛋白編碼區的非同義突變位點總數除以蛋白編碼區的總長度來計算每例患者的TMB[9]。最后利用Mann-Whitney檢驗分析共同高頻突變基因與TMB評分的相關性。

1.3 生物信息學分析

使用GSEA軟件4.1.0中的兩個基因集(c2.cp.kegg.v7.2.symbols.gmt和c7.all.v7.2.symbols.gmt)對與預后密切相關的突變基因進行基因富集分析[10]，通過標準化富集分數(NES)比較上述共同高頻突變基因在兩個基因集中的富集程度，以P<0.05和錯誤發現率(FDR)<0.25為顯著富集。使用CIBERSORT反褶積算法計算每例胃癌患者組織樣本TIICs的相對豐度[11]，并使用R軟件分析突變基因與TIICs的相關性。

1.4 統計學處理

使用R軟件4.0.2版本對數據進行統計分析。采用Kaplan-Meier法和對數秩檢驗估計患者總生存率。采用單變量Cox回歸分析確定患者總生存率的危險因素。以P<0.05為差異有顯著性。

2 結 果

2.1 胃癌突變基因與患者TMB評分及生存預后的關系

使用R軟件分析顯示，對TCGA和ICGC數據庫中突變頻率前30位的基因取交集后獲得21個共同高頻突變基因。Kaplan-Meier生存分析和Cox風險回歸分析顯示，21個共同高頻突變基因中，僅FAT4及MUC16突變與胃癌患者的總生存率相關，由于MUC16基因突變與胃癌的相關性已有相關研究報道[12]，故本研究后續只針對FAT4進行分析。Mann-Whitney檢驗分析顯示FAT4突變患者的TMB評分顯著升高(P<0.001)。

2.2 FAT4基因突變的富集分析

GSEA軟件分析顯示，FAT4基因突變患者主要富集于TMB評分相關的通路，例如KEGG堿基切除修復、KEGG DNA復制、KEGG錯配修復(圖1A)以及MEMORY-CD4-TCELL-VS-TH2-DN通路(圖1B);FAT4基因未突變的患者則主要富集于FOXP3-FUSION-GFP-TREG-UP通路(圖1B)。

2.3 高頻突變基因與TIICs的相關性分析

通過CIBERSORT反褶積算法計算結果顯示，每例胃癌患者的組織樣本中都含有22種TIICs，這些TIICs的種類名稱及其表達水平如圖2A所示。FAT4基因突變與TIICs的相關性分析的結果顯示，FAT4基因突變患者的組織樣本中活化的記憶性CD4+T細胞和濾泡輔助性T細胞浸潤豐度較高(P<0.05)，但Treg細胞和初始B細胞浸潤豐度較低(P<0.05)。見圖2B。

3 討 論

由于胃癌惡性程度高、異質性強，手術切除仍然是目前臨床常用的治療方法。但胃癌晚期患者往往術后預后較差。隨著分子生物學在腫瘤免疫治療中的應用，近年來晚期癌癥患者的治療取得了一定進展。一項針對胃癌患者的隨機對照試驗顯示，接受Nivolumab治療患者的總生存期較安慰劑組患者顯著延長[13]，提示免疫治療有望改善胃癌患者的治療效果。但目前免疫治療的受益群體有限。因此，尋找胃癌患者的預后生物標志物來指導免疫治療，具有重要的臨床價值。

本研究首先通過R軟件對TCGA數據庫以及ICGC數據庫中胃癌患者的體細胞突變情況進行分析并篩選出21個共同高頻突變基因。通過Kaplan-Meier生存分析方法和Cox風險回歸分析方法對這21個共同高頻突變基因進行分析，結果顯示，FAT4及MUC16突變與胃癌患者的總生存率及更高的TMB評分密切相關。FAT4是編碼原鈣黏蛋白家族的成員之一，在平面細胞極性的調節中起著重要作用。有研究發現FAT4在胃癌中高頻突變[14]，但具體機制尚不清楚。MUC16基因編碼一種膜系黏蛋白，該黏蛋白在其氨基末端包含一個胞外域、一個大串聯重復域和一個具有短胞質域的跨膜域。已有研究發現MUC16是胃癌中最常發生突變的基因之一，且其突變與胃癌患者更高的TMB評分、更強的抗腫瘤免疫反應及更好的臨床預后相關[15]。也有研究發現MUC16突變與免疫應答、抗原處理、細胞周期檢查點和DNA復制與修復相關的信號通路上調有關[16]。本研究對MUC16基因突變的后續分析與上述研究高度重復，因此本研究后續主要針對FAT4進行分析。TMB評分在基于腫瘤新抗原的表達來預測多種類型腫瘤的免疫檢查點阻斷反應中起重要作用。研究顯示，TMB評分是機體免疫反應的預測因子[17]，針對膀胱癌、黑色素瘤、腎細胞癌和頭頸部鱗狀細胞癌等研究發現，TMB評分升高的患者預后更好[18]。在本研究中，通過GSEA軟件針對FAT4基因突變的富集結果分析顯示，FAT4突變與錯配修復、DNA復制和堿基切除修復密切相關。有研究發現錯配修復、DNA復制和堿基切除修復是TMB評分升高的主要原因[19]。此外，高TMB評分與淋巴細胞對腫瘤細胞的識別關系密切[20]，這提示FAT4突變可能增強了淋巴細胞對腫瘤細胞的識別作用，從而提高了抗腫瘤免疫反應。本研究GSEA富集分析結果還顯示，在FAT4基因未突變的胃癌患者中，與FOXP3-FUSION-GFP-TREG-UP相關的信號通路上調。FOXP3蛋白是維持Treg細胞內環境穩定的重要轉錄因子[21]。Treg細胞是一種抑制性免疫細胞，維持免疫耐受，并下調過度的免疫反應[22]。因此，FAT4突變可能破壞Treg細胞介導的免疫耐受，進而促進抗腫瘤免疫反應。本研究通過CIBERSORT算法和R軟件針對FAT4突變與TIICs的相關性進行分析顯示，在FAT4突變患者中，活化的記憶性CD4+T細胞和濾泡輔助性T細胞浸潤豐度較高，Treg細胞浸潤豐度較低。有研究顯示，活化的記憶CD4+T細胞在腫瘤進展的早期階段發揮抗腫瘤免疫的主導作用[23]；在高TMB評分的乳腺癌患者中，濾泡輔助性T細胞通過激活B細胞使患者對免疫檢查點阻斷的反應更強[24]。在多種腫瘤中，例如乳腺癌、腎癌和非小細胞肺癌中，Treg細胞浸潤增加與患者較差的臨床預后情況有關[25-27]。在本研究中FAT4突變患者中活化的記憶CD4+T細胞和濾泡輔助性T細胞比例升高，提示FAT4突變可通過改變TIICs的比例來增強抗腫瘤免疫反應，延長患者的生存期。

A:KEGG通路的富集分析，B:免疫通路的富集分析

A:每例患者組織樣本中TIICs的相對豐度，B:FAT4基因突變患者(紅色)和FAT4基因未突變患者(藍色)與TIICs的相關性

綜上所述，本研究結果顯示，胃癌患者FAT4突變頻率較高，且與患者更好的臨床預后及較高的TMB評分有關。此外，FAT4突變可引起TIICs浸潤程度的改變，并增強抗腫瘤免疫功能。本研究對評估胃癌患者的預后有重要意義，可為胃癌患者的免疫治療提供理論和數據參考。