P16、Ki67在宮頸鱗狀上皮內病變中的表達及相關性研究

周劉勇 劉倩文 李燕紅

宮頸鱗狀上皮內病變（cervical squamous intraepithelial lesion，CIN）屬于宮頸癌前病變的一種，其發病是一個漸進的過程，經歷宮頸良性疾病、CIN、鱗狀細胞癌，其過程涉及多個基因改變，導致細胞增殖失控[1]。數據調查結果顯示，CIN好發于26～65歲女性，患者發病多與高危型人乳頭狀瘤病毒（high-risk human papilloma virus，HPV）感染有關[2]。因此，加強宮頸鱗狀上皮內病變患者診斷，對指導臨床治療具有重要的意義[3]。病理組織檢查是CIN診斷“金標準”，能確定病灶性質、嚴重程度，可指導臨床診療，但是該診斷方法在不同病理醫師之間的一致性有較大差異，尤其在病變CIN1、CIN2級。P16在臨床上使用較多，其表達水平異常能反映HPV感染情況，可反映細胞的調節、增殖，且在正常組織中表達水平較低[4]；Ki67是核抗原的一種，能影響細胞的增殖、分化，且在靜止期不會表達，其表達水平被視為對細胞群體的增殖活性進行精準反饋的重要指標[5]。因此，本研究以宮頸鱗狀上皮內病變患者為研究對象，探討P16、Ki67在宮頸鱗狀上皮內病變組織中的表達，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年5月—2021年2月宮頸鱗狀上皮內病變患者90例作為觀察組，年齡24～65歲，平均（39.93±10.41）歲；病程4～21個月，平均（10.59±3.21）個月；體質量指數（body mass index，BMI）18 ～ 29 kg/m2，平均（23.23±3.41）kg/m2；低級別鱗狀上皮內病變30例，高級別鱗狀上皮內病變60例（其中CIN2級35例、CIN3級25例）；所有患者均經活檢組織病理學確診，選擇同期治療的慢性宮頸炎患者20例為對照組，年齡26～63歲，平均（40.11±11.23）歲；病程4～22個月，平均（10.63±3.26）個月；BMI 19～30 kg/m2，平均（23.41±3.45）kg/m2。兩組患者一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會審核，患者或其家屬知情同意。

1.2 納入及排除標準

納入標準：（1）均為原發性宮頸疾病[6]，且患者具有完整的影像和臨床資料；（2）均完成P16、Ki67測定，且患者均可耐受；（3）病理檢查前均未行放化療，免疫治療。排除標準：（1）精神異常，有認知功能異常或血液系統疾病者；（2）器質性疾病，伴有自身免疫系統疾病，嚴重肝腎功能異常者；（3）凝血功能異常、全身感染性疾病者。

1.3 方法

（1）標本采集。采集兩組病理標本，置于福爾馬林溶液固定，石蠟包埋后制備4 μm切片，備用。（2）檢測方法。①測定步驟。采用LeicaBond-Max全自動免疫組化儀（德國徠卡公司）測定各組P16、Ki67蛋白陽性率。P16、Ki67為即用型工作液，均購于邁新生物技術開發有限公司，P16單克隆抗體（鼠單抗，克隆號：MX007），Ki67單克隆抗體（鼠單抗，克隆號：MX006）。上述操作完畢后進行再沖洗，返藍。梯度乙醇對標本脫水后在二甲苯的輔助作用下處理，中性樹膠封固（以鹽酸鹽緩沖液作為一抗陰性對照，利用已知陽性組織切片作為陽性對照）在400倍顯微鏡下對不同標本切片隨機取5個視野，每個視野選擇細胞200個計數，上述所有操作嚴格遵循儀器、試劑盒說明書完成[7]。②判定方法。不同組織測定完畢后，采用半定量方法進行測定及判斷。0分：陽性細胞占0%～10%；1分：陽性細胞占11%～25%；2分：陽性細胞占26%～50%；3分：陽性細胞占51%～75%；4分陽性細胞＞75%。0～3分陰性，4～5分弱陽性（+），6～7分中陽性（++），8～12分強陽性（+++）[8]。（3）一致性分析。對于高級別鱗狀上皮內病變患者分為CIN2和CIN3級，分析不同分級下P16、Ki67蛋白陽性率，并對P16、Ki67在宮頸鱗狀上皮內病變中的表達進行一致性分析。

1.4 統計學分析

采用SPSS 24.0軟件處理，計數和計量資料分別用率（%）和（）表示，分別采用χ2及t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組P16、Ki67陽性率比較

兩組均完成P16、Ki67陽性率測定，結果顯示，觀察組（低級別鱗狀上皮內病變和高級別鱗狀上皮內病變）P16、Ki67陽性率均高于對照組（χ2=7.392、8.916，P＜0.05）；高級別鱗狀上皮內病變中CIN3級患者P16、Ki67陽性率高于低級別鱗狀上皮內病變（χ2=5.691、8.525，P＜ 0.05），見表 1。

表1 兩組P16、Ki67陽性率比較[例（%）]

免疫組織化學法結果顯示，觀察組P16表達于胞核與胞漿中，呈棕黃色；而Ki67定位于細胞核中，呈黃色，且CIN分級越高，顏色越深；而對照組慢性宮頸炎下免疫組化下多呈陰性，見圖1。

圖1 不同組織中HE及免疫組化結果（200×）

2.2 高級別鱗狀上皮內病變中P16、Ki67一致性分析

高級別鱗狀上皮內病變一致性分析結果顯示，宮頸鱗狀上皮內病變中P16與Ki67無關聯性（P＞0.05）；而優勢性檢驗差異有統計意義（P＜0.05），見表2。

表2 高級別鱗狀上皮內病變中P16、Ki67一致性分析（例）

3 討論

宮頸癌是臨床上發生率較高的婦科惡性腫瘤，全球每年新增病例約為50萬，而我國每年新增病例為13.5萬，成為影響女性健康的重要原因。而CIN作為宮頸癌發生前的病變，是宮頸癌防治的重要階段，且目前CIN的診斷與分級存在諸多主觀因素，影響臨床治療方案[9]。因此，臨床上尋找一種簡便、準確判斷CIN及預測其轉歸的技術方法成為當前研究的熱點。

CIN是一組宮頸癌前病變的總稱，且對于低級別鱗狀上皮內病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）來說，65%的患者可以逆轉正常，20%的患者能維持穩定，且15%的CIN1級可能進一步發展。病理組織學檢查是CIN診斷金標準，能實現病灶的分期與診斷，為患者后續治療方案的制訂提供參考依據[10]。但是，傳統的病理學檢查在實際工作中存在諸多不足，如敏感性較低、可造成一定的誤診和漏診、可重復性較差等。研究顯示[11]，生物標志物能較為全面地反映細胞群體的增殖活性，其表達水平與腫瘤細胞的分化程度、浸潤和轉移存在緊密的聯系。P16最早由國外學者于1994年首次發現，屬于是一種細胞周期中的基本基因，在腫瘤細胞的分化、增殖中發揮了重要作用，可負調節細胞增殖、分裂，抑制腫瘤的生長。P16基因是一種能直接調控細胞周期的腫瘤抑制基因，通過阻止Rb基因的磷酸化，抑制細胞周期的進程，達到負性調控細胞增殖的目的。對于正常細胞周期中，P16表達水平較低或檢測不出，但是當細胞周期調控機制受損時，將會引起P16增殖活躍并呈高表達[12]。國內學者研究內顯示[13]，P16基因缺失，突變后，將會引起腫瘤的發生，發展，加強患者P16基因測定，可判斷腫瘤的易感性，對指導臨床治療具有重要價值。本研究中，觀察組（低級別鱗狀上皮內病變和高級別鱗狀上皮內病變）P16、Ki67陽性率均高于對照組（P＜0.05）；高級別鱗狀上皮內病變中CIN3級患者P16、Ki67陽性率高于低級別鱗狀上皮內病變患者（P＜0.05），提示P16、Ki67能直接參與宮頸鱗狀上皮內病變的發生、發展，亦可反映患者疾病嚴重程度，指導臨床診療。而Ki67在細胞增殖的各期中均有表達，但是在細胞靜止期G0不表達[14-15]。有研究發現[16]，Ki67的過度表達對細胞周期具有正調控作用，能加快腫瘤的發生發展，且隨著宮頸病變嚴重程度的增強，Ki67陽性率表達并呈升高趨勢。因此，Ki67表達水平與諸多腫瘤的分化程度、浸潤、轉移及預后存在緊密的聯系。既往研究顯示[17]，Ki67是核抗原，可影響細胞的增殖，Ki67過度表達，說明腫瘤細胞增殖活性高，能指導臨床治療。本研究中，高級別鱗狀上皮內病變一致性分析結果顯示，宮頸鱗狀上皮內病變中P16與Ki67無關聯性（P＞0.05）；而優勢性檢驗差異有統計意義（P＜0.05）。因此，臨床上對于宮頸鱗狀上皮內病變患者應加強其P16、Ki67測定，實現宮頸鱗狀上皮內邊的早期診斷；對于確診的宮頸鱗狀上皮內病變患者，積極采取相應的措施治療干預，加強患者P16、Ki67水平測定，評價患者預后，指導臨床治療，使得患者的治療更具科學性，降低宮頸癌發生率[18]。

綜上所述，P16、Ki67在宮頸鱗狀上皮內病變患者中呈高表達，且二者無顯著關聯性，加強患者P16、Ki67聯合檢測能提高診斷準確性，指導臨床診療。