細胞因子與病毒性肝炎相關慢加急性肝衰竭預后的關系

楊蔚 張美玲 駱小娟

慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure，ACLF）是慢性肝病可能在短時間內出現急性肝臟損傷的一種情況，臨床主要表現為黃疸和凝血功能障礙。乙型肝炎是我國肝衰竭主要病因之一[1]，整個病程包括肝組織的自身免疫傷害、組織缺血缺氧和內毒素三大要素，其中誘發肝衰竭的主要因素為免疫損傷[2]。其發生機制是因為在肝臟的炎癥反應階段內，多種細胞因子發揮了生物學作用[3]，如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）等[4]。目前已有研究表明[3]細胞因子在ACLF的發生、發展中發揮了重要的作用，但暫且缺少更細層面的分析。本研究檢測了所有研究對象的多項細胞因子，以IL為主，目的在于探討細胞因子是否與ACLF病情嚴重程度相關，以及如何影響患者臨床轉歸。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年2月—2021年5月本院收治的乙型病毒性肝炎（hepatitis B virus，HBV）相關ACLF患者24例，列為 ACLF組。經過治療，在全部24例患者中被治愈的患者為16例，治愈患者癥狀或體征消失，或明顯好轉，肝功能恢復至正常水平；而未治愈8例均已死亡，其中5例臨床死亡，3例經專家評估無治愈可能，家屬簽字放棄治療。納入標準：肝衰竭符合2018版《肝衰竭診治指南》[5]、乙肝診斷標準為符合以2015版《慢性乙型肝炎防治指南》為診斷標準[6]。將同期住院的25例慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者設置為CHB組。同時期健康體檢志愿者被列為健康對照組，共25例。排除標準：排除其他肝炎病毒（如丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒等）的多重感染、排除獲得性免疫缺陷病，排除敗血癥、深部真菌感染，排除藥物、酒精、自身免疫反應等其他 因素引起的肝損傷，排除既往或近期使用免疫抑制劑治療者。本研究通過湛江市第四人民醫院倫理委員會批準。三組研究對象的一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05）,具有可比性，見表1。

表1 三組研究對象一般資料比較

1.2 方法

患者及體檢者入院時，即采集其空腹外周血，采用凝膠分離管及時分離血清，分裝置入-20℃冰箱冷凍保存，統一檢測所有樣本的白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）、白細胞介素 4（interleukin-4，IL-4）、白細胞介素 6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素8（interleukin-8，IL-8）、白細胞介素10（interleukin-10，IL-10），白細胞介素 12（interleukin-12，IL-12）、γ干擾素（γ interferon，IFN-γ）和TNF-α在外周血中的水平。試劑盒購于美國BIO-RAD公司。操作嚴格按照說明書進行。檢測儀器為美國BIO-RAD公司制造的Bio-Plex200LUMINEX儀，洗板機為邁瑞MW-12A。

血清樣本的所有生化項目由全自動生化分析儀檢測，儀器為日本生產富士700，試劑為儀器配套提供。乙型肝炎5項采用全自動電化學發光法檢測，儀器為德國羅氏Cobase601化學發光酶免疫分析儀與其配套試劑。IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α在外周血中的水平以化學發光方式進行檢測，HBV DNA檢測使用熒光聚合酶鏈反應，采用美國ABI-7300型儀器，HBV核酸定量檢測試劑盒由湖南圣湘生物科技公司提供。

1.3 觀察指標及評價標準

觀察IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α在外周血中的水平，HBV核酸在外周血中的定量結果。終末期肝病模型（model for end-stage liver disease，MELD）用于年齡≥12歲的患者，評分為6～40分，得分越高，病情越嚴重，計算公式為：R=3.78×ln[TBiL（mg/dL）]+11.2×ln（INR）+9.57×ln[Cr（mg/dL）]+6.43*（膽汁性或酒精性 0，其他1）[7-8]，R＞18分為高危；15～18分為中危；≤14分為低危。

1.4 統計分析

所有數據均檢測三次并取均值，并進行正態性檢驗，若不符合正態分布則采用[M（P25，P75）]表示，進行Kruskal-Wallis檢驗，組間用Mann-WhitneyU檢驗。雙側P＜0.05表示差異具有統計學意義，采用SPSS 22.0進行分析。預測效能采用受試者工作曲線（ROC）下面積（AUC）表示。

2 結果

2.1 各組細胞因子水平比較

ACLF組IL-6、IL-8、IL-12和TNF-α顯著高于CHB組（P＜0.05），CHB組與健康對照組間水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2、表3。

表2 各組細胞因子水平比較[M（P25，P75）]

表2 （續）

表3 具體統計量

2.2 不同臨床轉歸患者之間細胞因子水平差異和MELD評分比較

ACLF患者中，死亡患者IL-6、TNF-α水平和MELD評分顯著高于治愈組（P＜0.05）。見表4。

表4 不同臨床轉歸患者細胞因子水平和MELD評分比較

2.3 IL-6、TNF-α水平和MELD評分對病情轉歸的預測效能

通過計算，IL-6、TNF-α水平和MELD評分的AUC分別為0.684、0.733、0.687，通過比較，TNF-α水平的AUC顯著高于IL-6水平和MELD評分。見圖1。

圖1 IL-6、TNF-α水平和MELD評分ROC曲線病情轉歸的預測效能

3 討論

我國是乙型肝炎高發國，相當部分患者ACLF與HBV感染相關[9]，其發生機制目前尚未完全明確。肝衰竭在臨床嚴重肝病患者中屬于常見的癥候群，病死率極高。各國學者多年來不斷探索肝衰竭的定義、病因、分類、分型、診斷和治療、預后判斷等問題。國際上做了很多循證醫學臨床研究，2012年，歐洲29個中心共同對肝硬化急性失代償患者進行前瞻性研究，樣本來自歐洲8個國家29個肝病中心，共1 343例，均為肝炎急性失代償住院患者。將28 d內病死率設定在15%作為ACLF的標準進行篩查，最后發現多臟器功能衰竭（multiple organ failure，MOF）是導致高病死率的原因。發生多臟器功能衰竭是肝炎失代償期出現高病死率的原因。將ACLF定義為患者本身具有慢性肝病，并隨之出現肝功能急性惡化，直至危機事件出現，多在4周內發生多器官功能衰竭，因此病死率居高不下。ACLF的定義，國際上認為ACLF必須是一個快速進展的，高病死率的群體。

推測ACLF重要病理生理過程之一是系統性炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），其中起著重要作用的可能是細胞因子。SIRS指全身的炎癥反應（身體對多種細胞因子/炎癥介質的反應），內毒素是全身性炎癥反應（systemic inflammatory response，SIR）的觸發劑，沒有特效藥物可治愈。無論是感染性還是非感染性因素，都可通過相應的途徑來激活免疫細胞，釋放TNF-α、IL-1等細胞因子介質，參與機體免疫反應以抵御外界對機體的刺激。這些免疫細胞不僅能夠激活粒細胞，損傷內皮細胞，激活血小板黏附反應，釋放多種脂質代謝產物與氧化自由基等，并進一步激活免疫細胞，同時在機體內形成一系列級聯反應，引起更多炎癥介質因子的產生，加速炎癥反應發生發展。機體代償能力若失衡，則將引起廣泛組織細胞損傷，引發全身免疫細胞被激活從而引起一系列綜合征。同時內源性免疫炎性因子在機體中產生后形成級聯反應。危重患者因機體代償性抗炎反應能力降低以及代謝功能紊亂，最易引發SIRS。嚴重者可導致多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）。

有學者認為，人體感染HBV后，CD8+T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）攻擊受到感染HBV的肝細胞，造成大量的肝細胞溶解和凋亡。這種肝損傷激活Kuffer細胞釋放多種細胞因子，這些細胞因子不僅直接損傷肝細胞，還進一步募集大量固有免疫細胞趨化至肝臟，加重肝臟的損傷，從而引起肝衰竭[10-11]。

由免疫細胞（如單核-巨噬細胞、T、B淋巴細胞、自然殺傷細胞等）和其他非免疫細胞（內皮細胞、上皮細胞、成纖維細胞等）合成、分泌的細胞因子，是一大類小分子蛋白質，具有廣泛生物學活性。這些細胞因子與相應受體結合，調節細胞周期、影響細胞分化和引起細胞學效應，調控免疫應答，是一類蛋白質，分子量低，能由抗原、絲裂原或其他因素誘導多種細胞產生，無論是固有免疫應答還是適應性免疫應答、干細胞分化成熟、細胞生長及幫助損傷組織自行修復等多種功能。細胞因子可被分為六大類，分別是白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子超家族、集落刺激因子、趨化因子、生長因子。根據其功能又分為促炎性與抗炎性細胞因子兩大類[12-13]。大量細胞因子在體內通過三種分泌方式（旁分泌、自分泌或內分泌）發揮作用，其生理特性具有多效性、重疊性、拮抗性、協同性等特點，以復雜的網絡形式參與調節人體多種重要生理功能。因此細胞因子的研究具有重大應用價值，有助于從分子水平闡述免疫調節的機制，有助于臨床預防、診斷疾病，也可用細胞因子進行疾病治療，目前，利用基因工程技術，已經將重組細胞因子用于治療多種與免疫相關的疾病，如腫瘤、炎癥等，效果可喜，具有廣闊應用前景。

本研究通過對研究對象相應細胞因子比較，發現ACLF組患者外周血中IL-6、IL-8和TNF-α水平顯著高于另外兩組（P＜0.05）。Grünvogel等[4]提出這種現象可能是ACLF發生的免疫病理機制。

本研究比較了死亡組和治愈組患者之間的IL-6、IL-8和TNF-α水平，結果表明，死亡組IL-6和TNF-α水平顯著高于治愈組（P＜0.05），表明預后不佳時IL-6和TNF-α水平大幅升高，MELD評分是用于判斷終末期肝病嚴重程度和生存率的預測指標，本研究中ACLF患者MELD評分也顯著高于其他兩組患者，有文獻[2]認為血清IL-6水平跟肝細胞壞死程度正相關，認為其在一定程度提示急性肝衰竭嚴重程度，但這兩者對預后是否有判斷作用，還需要通過AUC的計算與比較來進行研究。IL-6和TNF-α與ACLF的并發癥之間可能互為因果、相互促進[14-15]。結果顯示三者AUC絕對值均＞0.5，均對ACLF的預后有提示作用，其中TNF-α數值最大。

綜上所述，檢測血清中的IL-6和TNF-α有助于判斷ACLF患者疾病嚴重程度和臨床轉歸。然而，細胞因子來源復雜，需結合臨床綜合判斷。另外，因研究對象特殊而使ACLF組樣本量較小，更可靠的截斷值計算需在更大樣本量的基礎上進行，本研究后續仍需要進一步加大樣本量驗證。