柚皮素通過抑制miR-29b 的過表達對3T3-L1 脂肪細胞胰島素抵抗的影響

王 元曾凱宏?鄧 波余雪梅周 雪宋 怡黃璐嬌

(1.四川省醫學科學院·四川省人民醫院臨床營養科,成都 610072;2.電子科技大學醫學院,成都 610054)

糖尿病是當代社會危害人類健康的重大疾病之一,如何有效預防糖尿病的發生和控制其發展,得到科研界廣泛關注和重視[1]。 近年來研究發現,二氫黃酮類化合物柚皮素可顯著降低Ⅱ型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)大鼠糖化血紅蛋白和空腹血糖值,有防治T2DM 的作用[2-3],但柚皮素防治T2DM 的機制及具體分子靶點是什么? 目前還有爭議,需進一步研究證實。 機體外周組織(如骨骼肌、脂肪組織等)及其細胞產生的胰島素抵抗(insulin resistance, IR) 是T2DM 的發病機理之一[4],臨床研究發現T2DM 患者血清中miR-29b 上升[5],動物實驗研究發現T2DM 大鼠肝、骨骼肌和脂肪組織中miR-29b 均被上調[6],表明miR-29b 的高表達與T2DM 的發病機理相關。 因此,本文選擇了3T3-L1 脂肪細胞作為研究對象,探討柚皮素對3T3-L1 細胞的胰島素抵抗效應的影響,并進一步探討了miR-29b 的過表達與柚皮素在3T3-L1 細胞的胰島素抵抗效應之間的關系。

1 材料和方法

1.1 細胞

小鼠成纖維細胞株(3T3-L1)購自于美國菌種保藏中心(ATCC)。

1.2 主要試劑與儀器

柚皮素購自于BBI Life Science 公司;miR-29b mimics、miR-29b inhibitor 購自于上海Genepharma 公司;DMEM 培養基、胎牛血清(FBS)購自于Gibco 公司;地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、胰島素購自于Sigma 公司;磷酸緩沖液(PBS)購自于Hyclone 公司;IRS-1、GLUT4、p-Akt 購自于Abcam 公司;IgG 兔抗鼠購自于CST 公司;蛋白RIPA 裂解液、TBST 購自于Solarbio 公司;去gDNA 反轉錄試劑盒、iTaqTMUniversal SYBR?Green Supermix 購自于Bio-Rad 公司;脂質體Lipofectamine TM 2000 購自于Invtrogen 公司;蛋白預染marker 購自于Mercodia 公司。 PCR 擴增儀購自于Applied Biosystems;qPCR儀器型號ABI 7500 型。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養與誘導分化

將3T3-L1 前脂肪細胞接種于含10% FBS 的DMEM 中,放于37℃、5% CO2、相對濕度95%培養箱中培養。 待細胞融合2 d 后,加入含1 μmol/L 地塞米松、0.5 mmol/L IBMX、10 mg/L 胰島素的培養液,培養48 h,然后換含10 mg/L 胰島素的培養液繼續培養,以后每48 h 換1 次培養液,至7~10 d,待細胞分化成功[7],用油紅“O”染色進行鑒定,85%以上的細胞分化成為脂肪細胞。

1.3.2 胰島素抵抗模型的建立、鑒定及實驗分組

將培養液換成含10% FBS、5 mmol/L 低糖培養液培養48 h,再用無血清的低糖培養基培養12 h,最后換入含10% FBS、100 nmol/L 胰島素的DMEM、25 mmol/L 高糖培養液,干預30 min,從而建立3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗模型[8],與對照組比較,模型組細胞葡萄糖攝取明顯減少,說明細胞出現胰島素抵抗,提示建模成功。

細胞分組:分別用不同濃度(0、25、50、100 μg/mL)的柚皮素干預24 h,建立如下分組:正常對照組(正常培養基培養的細胞,未干預,NC 組)、模型組(IR 模型細胞,未干預,IR 組)、溶劑模型組(IR 模型細胞+4 μL/mL DMSO,IR-V 組)、25 μg/mL 柚皮素干預IR 組(IR 模型細胞+25 μg/mL 柚皮素,IRL-Nar 組)、50 μg/mL 柚皮素干預IR 組(IR 模型細胞+50 μg/mL 柚皮素,IR-M-Nar 組)、100 μg/mL 柚皮素干預IR 組(IR 模型細胞+100 μg/mL 柚皮素,IR-H-Nar 組)。

1.3.3 細胞葡萄糖消耗檢測

上述各實驗組去掉培養液后,每孔加相應量含10% FBS DMEM 培養基培養2 h,按照GOD 法試劑盒說明書所述方法測定各孔內剩余葡萄糖含量,使用酶標儀在570 nm 波長處測量各孔OD 值,根據標準濃度測出的標準曲線計算各孔中葡萄糖含量,葡萄糖消耗量=空白對照組葡萄糖含量-待測組葡萄糖含量。

1.3.4 細胞轉染及轉染后分組

將其中miRNA-29b mimics (40 nmol/L) 和miRNA-29b inhibitor (200 nmol/L) 在50 μg/mL 柚皮素干預前加入前1 h 通過Lipofectamine TM 2000轉染入3T3-L1 細胞內。

轉染效率實驗分組:Cell+IR 未轉染組:IR;Cell+IR+miR-29b mimics 轉染組:IR-miR-29b-mimic;Cell+IR+mimic 轉染陰性對照組:IR-mimic-NC;Cell+IR+miR-29b inhibitor 轉染組:IR-miR-29b-inhibitor;Cell+IR+inhibitor 轉染陰性對照組:IR-inhibitor-NC。

柚皮素干預實驗分組:Cell+普通培養液組:NC;Cell+IR 組:IR;Cell+IR+miR-29b mimics 轉染組:IRmiR-29b;Cell+IR+miR-29b inhibitor 轉染組:IR-antimiR-29b;Cell+IR+50 μg/mL Nar 組:IR-Nar;Cell+IR+miR-29b mimics+50 μg/mL Nar 組:IR-miR-29b-Nar;Cell+IR+miR-29b inhibitor+50 μg/mL Nar 組:IR-anti-miR-29b-Nar。

1.3.5 實時熒光定量聚合酶鏈式反應

分別收集各實驗組中細胞,用TRIzol 試劑提取總RNA,測定GLUT4、IRS1、AKT 用TaKaRa 逆轉錄試劑盒進行逆轉錄,采用SYBR Green PCR 試劑盒進行Real-time PCR,測定miR-29b 按照MicroRNA Reverse Transcription Kit 和MicroRNA Assays 試劑盒說明書進行Real time PCR,以U6 為內參,根據qPCR 反應曲線得到各組樣品目的基因和內參基因的Ct 值。 首先計算△△Ct值=(實驗組目的基因的Ct平均值-實驗組內參基因的Ct 平均值)-(對照組目的基因的Ct 平均值-對照組目的內參基因的Ct 平均值),則基因相對表達量為2-△△Ct。 引物序列見表1。

表1 引物序列的核苷酸序列Table 1 Nucleotide sequence of primer

1.3.6 Western blot 檢測

收集各組細胞,用1% PMSF 的RIPA 細胞裂解液在冰上進行裂解細胞,離心取上清,BCA 法測定總蛋白質濃度,使用10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白,轉印到PVDF 上,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,加入一抗后在4℃溫度下孵育過夜,TBST 洗膜3次,每次10 min,加入相應二抗室溫孵育1 h,ECL 法凝膠成像系統處理,對各組條帶進行計值及統計分析。

1.4 統計學方法

使用SPSS 20.0 統計軟件分析處理,定量數據采用平均數±標準差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,方差齊時采用SNK 法,方差不齊時采用Dunnett’s T3 檢驗,P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3T3-L1 細胞和成熟脂肪細胞的形態及鑒定

如圖1A,3T3-L1 細胞呈長梭形,貼壁,不聚團生長。 如圖1B 和1C,誘導3T3-L1 細胞8 d 后,可見細胞均呈現典型的脂肪細胞表型,細胞中富含脂滴,脂滴可被油紅“O”染色,含脂滴細胞>85%時,大部分3T3-L1 細胞已被誘導為脂肪細胞,可用于進一步實驗。

2.2 柚皮素干預對胰島素抵抗3T3-L1 模型細胞糖代謝的影響

與正常對照組比較,模型組3T3-L1 脂肪細胞的葡萄糖消耗量顯著降低(P<0.001);與模型組比較,溶劑干預模型組細胞的葡萄糖消耗量無差別,各柚皮素干預組細胞的葡萄糖消耗量均升高(P<0.01),且50 μg/mL 柚皮素干預IR 組最顯著(P<0.001),其中詳見表2。

表2 柚皮素對胰島素抵抗3T3-L1 模型細胞葡萄糖攝取的影響(xˉ±s, n=3)Table 2 Effect of naringenin on glucose consumption in IR 3T3-L1 cells

2.3 柚皮素對胰島素抵抗3T3-L1 模型細胞IRS-1/Akt/GLUT4 基因表達的影響

如圖2,與正常3T3-L1 細胞未干預組相比,IR模型未干預組細胞中IRS-1、AKT、GLUT4 的mRNA表達均明顯下降,其差異具有統計學意義(P<0.001)。 與IR 組比較,IR-L-Nar 組、IR-M-Nar 組、IR-H-Nar 組柚皮素干預均能促進IRS-1、Akt、GLUT4的mRNA 表達,其中IR-L-Nar 組、IR-M-Nar 組對3種基因表達增加最明顯(P<0.01),即25 μg/mL 和50 μg/mL 柚皮素干預最明顯(P<0.001)。 溶劑組基因的表達與IR 組比較,無差別。

2.4 柚皮素對胰島素抵抗3T3-L1 模型細胞IRS-1/p-Akt 蛋白表達的影響

如圖3A 和3B 所示,與正常培養3T3-L1 細胞相比,3T3-L1 IR 模型未干預組細胞中IRS-1、p-Akt的蛋白表達均明顯下降;與IR 模型未干預組相比,柚皮素干預組IRS-1、p-Akt 的蛋白表達均增加,其中25 μg/mL 柚皮素組IRS-1 增加最明顯(P<0.001),50、100 μg/mL 柚皮素組p-Akt 增加最顯著(P<0.001),溶劑組蛋白的表達與模型組無差別。

注:與正常對照組相比,???P< 0.001;與模型組相比,## P<0.01,###P<0.001。圖2 柚皮素干預對3T3-L1 胰島素抵抗模型細胞基因表達的影響Note. Compared with NC group, ???P<0.001. Compared with IR group, ##P<0.01, ###P<0.001.Figure 2 Effect of naringenin intervention on gene expression of 3T3-L1 insulin resistance model cells

注:與正常對照組相比,???P<0.001;與模型組相比,##P<0.01,###P<0.001。圖3 各組3T3-L1 細胞蛋白表達量Note. Compared with NC group, ???P<0.001. Compared with IR group, ##P<0.01,###P<0.001.Figure 3 Expression level of protein in 3T3-L1 cells in each group

注:A: 誘導前3T3-L1 細胞;B: 誘導成功3T3-L1 脂肪細胞;C: 3T3-L1 脂肪細胞經油紅“O”染色。圖1 3T3-L1 細胞的形態及鑒定Note. A, 3T3-L1 cells before induction. B, Successfully induced 3T3-L1 adipocytes. C, 3T3-L1 adipocytes were stained with oil red “O”.Figure 1 Morphology and identification of 3T3-L1 cells

2.5 對3T3-L1 細胞轉染miR-29b 的鑒定

如圖4 所示,與Cell+IR 未轉染組相比,3T3-L1細胞被轉染后Cell+IR+miR-29b mimic 組細胞的miR-29b 表達明顯上升(P<0.001),Cell+IR+miR-29b-inhibitor 組miR-29b 的表達水平降低(P<0.001),Cell+IR+mimic 轉染陰性對照組和Cell+IR+inhibitor 轉染陰性對照組與Cell+IR 細胞未轉染組miR-29b 表達一致。 此結果表明miR-375-mimic 和miR-375-inhibitor 被成功轉染進入3T3-L1 IR 細胞。

注:與Cell+IR 未轉染組相比,###P<0.001。圖4 3T3-L1 脂肪細胞轉染結果Note. Compared with IR group, ###P<0.001.Figure 4 Transfection results of 3T3-L1 adipocytes

2.6 柚皮素對3T3-L1 細胞miR-29b 上調/下調后IRS-1/Akt/GLUT4 基因表達的影響

如圖5,與Cell+普通培養液組相比,Cell+IR 模型組3T3-L1 細胞中IRS-1、Akt、GLUT4 的mRNA 表達均明顯下降,其差異具有統計學意義(P<0.001);Cell+IR 模型組相比,Cell+IR+miR-29b mimics 轉染組3T3-L1 細胞中IRS-1、Akt、GLUT4 的mRNA 表達均降低(P<0.001),而Cell+IR+50 μg/mL Nar 組IRS-1、Akt、 GLUT4 的mRNA 表 達 均 增 加(P<0.001),Cell+IR+miR-29b mimics+50 μg/mL Nar 組IRS-1、Akt、GLUT4 的mRNA 表達均上升,且差異有統計學意義(P<0.001),Cell+IR+miR-29b inhibitor轉染組和Cell+IR+miR-29b inhibitor+50 μg/mL Nar組細胞中IRS-1、Akt、GLUT4 的mRNA 表達量均無差異;與Cell+IR+50 μg/mL Nar 模型組比較,Cell+IR+miR-29b inhibitor+50 μg/mL Nar 組IRS-1、Akt、GLUT4 的mRNA 表達量下降(P<0.001)。

2.7 柚皮素對3T3-L1 細胞miR-29b 上調/下調后IRS-1/p-AKT 蛋白表達的影響

如圖6A 和6B 所示,與Cell+普通培養液組相比,Cell+IR 模型組3T3-L1 細胞中IRS-1、p-Akt 的蛋白表達均明顯下降(P<0.001);與Cell+IR 模型組比較,Cell+IR+miR-29b mimics 轉染組3T3-L1 細胞中IRS-1、p-Akt 的蛋白表達均降低(P<0.001),Cell+IR+miR-29b inhibitor 轉染組細胞中IRS-1、p-Akt的蛋白表達均無明顯變化,Cell+IR+50 μg/mL Nar組IRS-1、p-Akt 的蛋白表達均增加(P<0.001),Cell+IR+miR-29b mimics+50 μg/mL Nar 組IRS-1、p-Akt的蛋白增加(P<0.001),Cell+IR+miR-29b inhibitor+50 μg/mL Nar 組IRS-1、p-Akt 的蛋白表達無變化;與Cell+IR+50 μg/mL Nar 組比較,Cell+IR+miR-29b mimics+50 μg/mL Nar 組IRS-1、p-Akt 的蛋白增加(P<0.05),Cell+IR+miR-29b inhibitor+50 μg/mL Nar 組IRS-1、p-Akt 的蛋白下降(P<0.05)。

3 討論

柚皮素是二氫黃酮類化合物柚皮苷的苷元,研究發現膳食補充柚皮素可以顯著降低鏈脲佐菌素(streptozocin, STZ)誘導的DM 小鼠的空腹血糖和血漿的糖化血紅蛋白值,明顯升高糖尿病小鼠血漿中胰島素濃度[9],可以改善STZ 誘導的DM 小鼠的炎癥反應[10]。 在3T3-L1 脂肪細胞中,柚皮素以劑量依賴方式抑制胰島素刺激的葡萄糖攝取,從而增加脂肪細胞胰島素抵抗發生[11]。 在本課題前期的研究中發現柚皮素干預可以提高3T3-L1 IR 細胞模型葡萄糖的攝取和胰島素敏感性[12],但柚皮素影響3T3-L1 脂肪細胞的具體分子機制尚不清楚。

注:與Cell+普通培養液組相比,???P<0.001;與Cell+IR 組相比,##P<0.01,###P<0.001;與Cell+IR+miR-29b mimics 轉染組相比,&&&P<0.001。圖5 柚皮素干預對3T3-L1 細胞轉染miR-29b mimics/inhibitor 后基因表達的影響Note. Compared with NC group, ???P<0.001. Compared with IR group, ##P<0.01, ###P<0.001. Compared with IR-miR-29b group,&&&P<0.001.Figure 5 Effect of naringenin intervention on the gene expression of 3T3-L1 adipocytes transfected with miR-29b mimics/inhibitor

注:與Cell+普通培養液組相比,???P<0.001;與Cell+IR 組相比,###P<0.001;與Cell+IR+miR-29b mimics 轉染組相比,&P<0.05,&& P<0.01。圖6 柚皮素影響轉染miR-29b mimic/inhibitor 3T3-L1 細胞IRS-1、p-Akt 的蛋白表達量Note. Compared with NC group, ???P<0.001. Compared with IR group, ###P<0.001. Compared with IR+miR-29b group, &P<0.05,&&P<0.01.Figure 6 Effect of naringenin on the protein expression of IRS-1 and p-Akt in miR-29b mimics/inhibitor 3T3-L1 cells transfected

胰島素是體內降低血糖的唯一激素,當胰島素信號傳導通路發生障礙時,機體產生胰島素抵抗,導致肝、脂肪、骨骼肌等靶組織的葡萄糖攝取和利用率降低[13-14]。 胰島素信號傳導通過胰島素受體促進胰島素與胰島素受體底物IRS-1、IRS-2 的結合,然后將信號發出,激活胰島素下游信號傳導通路的蛋白激酶位點,如Akt(也稱PKB,PI3K 信號通路成員)被激活[15-16],進而觸發下游葡萄糖轉運體-4(glucose transporter-4, GLUT-4)向膜轉運,降低靶細胞對葡萄糖的攝取能力,引起胰島素抵抗的發生[17],基于此本實驗探究了柚皮素對3T3-L1 脂肪細胞胰島素抵抗的影響,結果發現3T3-L1 IR 細胞模型IRS-1、GLUT-4 基因和蛋白表達明顯降低,通過柚皮素的干預可以起到提高IRS-1/Akt 信號通路的基因和蛋白表達的作用。

MicroRNA(miRNA)是約20~24 個核苷酸的非編碼小分子RNA,主要在轉錄水平上,通過促進目標靶基因降解或抑制其翻譯,從而減弱目標靶基因的功能[18]。 近年來大量研究發現miRNA-29 對糖尿病的發生和胰島素抵抗的調節作用,Mohammed等[5]在臨床試驗中證實T2DM 患者血清中miR-29b升高,且miR-29b 的高表達與T2DM 疾病嚴重程度相關, Massart 等[6]通過研究 miRNAs 在 Goto-Kakizaki(GK)大鼠骨骼肌中的表達,鑒定出兩種miR-29 被上調,分別是miR-29a 和miR-29b。 Kurtz等[19]研究胰島素抵抗時發現,在小鼠胰島素抵抗模型的肝中miR-29 的表達水平比正常小鼠升高。Dooley 等[20]在進行體外試驗中,發現3T3-L1 脂肪細胞系中高表達的miR-29 可降低胰島素刺激的葡萄糖攝取,從而緩解3T3-L1 脂肪細胞胰島素抵抗。還有研究報道在高糖、高胰島素誘導體外胰島素抵抗模型中,高表達的miR-29 可抑制Akt 的激活,降低脂肪細胞對葡萄糖的攝取能力,引起胰島素抵抗發生[21-22]。 柚皮素對胰島素抵抗的影響是否也與高表達的miR-29 相關,目前尚無相關報道。 因此,本研究進一步探索了柚皮素對胰島素抵抗的影響與高表達的miR-29b 的關系,結果發現柚皮素通過抑制miR-29b 的高表達介導3T3-L1 細胞IRS-1/Akt信號通路中相關蛋白的表達,最終改變胰島素抵抗對脂肪細胞的影響,增強3T3-L1 細胞對胰島素的敏感性,促進葡萄糖吸收的作用,然而本研究結果仍不能完全解釋柚皮素與改善胰島素抵抗的作用,下一步將從多個蛋白靶點、多個調控環節繼續深入研究,闡明柚皮素改善T2DM 的作用及其分子機制。