不同施肥措施對華北潮土區玉米田土壤固碳細菌群落結構多樣性的影響

劉紅梅，海香，安克銳，張海芳，王慧，張艷軍，王麗麗，張貴龍，楊殿林

農業農村部環境保護科研監測所，天津 300191

土壤是陸地生態系統重要的有機碳庫，土壤有機碳固存相關研究已成為全球農田生產力、生物多樣性和固碳減排等相關領域研究的熱點問題之一。根據政府氣候變化專門委員會（IPCC）統計，全球每年的固碳潛力高達4.3 Pg CO2，其中90%來自土壤對大氣CO2的固存（Smith et al.，2008）。增加土壤有機碳的固存量，既可提高土壤肥力，又可降低土壤CO2釋放，促進農田土壤向大氣CO2的“匯”轉變（Karl-Heinz et al.，2017）。土壤對大氣 CO2的固定主要是土壤自養微生物參與的同化過程（陳曉娟等，2014）?？栁难h是自養微生物同化CO2的最主要途徑（Berg，2011），該過程中起關鍵作用的酶是 1, 5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（RubisCO）。cbbL是RusbisCO的編碼基因之一，具有高度保守性，常作為環境中卡爾文循環自養固碳微生物群落多樣性的標記物（Nanba et al.，2004；劉瓊等，2017），已被國內外學者應用到生物固碳分子生態學研究中（Tolli et al.，2005；高靜等，2018；蘇鑫等，2020）。

農田生態系統是陸地生態系統中受人為干擾最大同時也是固碳潛力最大的碳庫之一（Simth，2004）。施肥通過改變土壤養分（李倩等，2018）而改變微生物群落結構和多樣性（陸海飛等，2015；劉紅梅等，2020），進而影響土壤微生物的 CO2的固定能力（陳曉娟等，2014）和作物產量（俄勝哲等，2018）。Yuan et al.（2013）通過功能基因cbbL分子標記技術發現，稻田土壤cbbL具有高的多樣性，且其與碳同化速率呈顯著正相關關系。土壤固碳酶（RusbisCO）活性高，表明土壤自養微生物同化 CO2的潛力高（陳曉娟等，2014）。Selesi et al.（2005）研究發現，施用化學肥料和混合堆肥后小麥田土壤cbbL基因群落組成和多樣性發生了明顯改變。Yuan et al.（2012）研究表明，長期施肥導致農田土壤碳同化自養種群結構產生了明顯差異，固碳優勢菌群也發生了相應變化。張雙雙等（2019）研究表明，土壤pH、有機碳、總氮等土壤因子是影響固碳細菌群落結構差異的主要影響因子。研究不同施肥措施下土壤固碳細菌群落變化和引起其變化的主控土壤理化因子，對明晰不同施肥措施下農田土壤固碳機制和農業可持續發展具有重要意義。

華北平原是我國主要的糧食主產區，以小麥/玉米輪作一年兩熟制為主要種植制度，在保障我國糧食生產中起著重要作用。但該地區存在過量施氮現象，易造成氮素揮發損失、面源污染等環境問題，如何在合理施肥同時提高土壤固碳潛力需要科學數據支持。目前，長期不同施肥措施對華北農田土壤固碳細菌微生物群落結構多樣性的影響還不明確。為此，本研究以農業農村部環境保護科研監測所武清野外科學試驗站長期定位試驗中小麥-玉米輪作農田為研究對象，利用Illumina MiSeq高通量測序技術，研究不同施肥措施對華北農田土壤卡爾文循環功能基因cbbL群落結構多樣性的影響及與土壤理化性質間的關系，以期為提高土壤固碳潛力和農業可持續管理提供理論依據和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于農業農村部環境保護科研監測所武清野外科學試驗站（39°21′N，117°12′E）。屬溫帶半濕潤大陸性季風氣候，四季分明。年平均氣溫11.6 ℃，年均降水量520—660 mm，年平均無霜期為196—246 d。土壤類型為潮土。試驗開始前土壤基本理化性質為：土壤全氮1.18 g·kg?1，全磷0.72 g·kg?1，全碳 10.83 g·kg?1，硝態氮 19.95 mg·kg?1，銨態氮 5.06 mg·kg?1，速效磷 18.6 mg·kg?1，pH 7.58。

1.2 試驗設計及樣品采集

自2010年開始長期試驗，試驗設6個施肥處理：對照A0（不施肥），單施有機肥A1（有機肥15 t·hm?2），氮肥減量配施有機肥 A2（有機肥 15 t·hm?2，N 基肥 55.2 kg·hm?2、追肥 36.8 kg·hm?2，P2O581.0 kg·hm?2，K2O 75.0 kg·hm?2），常量化肥配施有機肥 A3（有機肥 15 t·hm?2，N 基肥 117.3 kg·hm?2、追肥 78.2 kg·hm?2，P2O581.0 kg·hm?2，K2O 75.0 kg·hm?2），氮肥增量配施有機肥A4（有機肥15 t·hm?2，N基肥 172.5 kg·hm?2、追肥 115.0 kg·hm?2，P2O581.0 kg·hm?2，K2O 75.0 kg·hm?2），單施化肥A5（N 基肥 117.3 kg·hm?2、追肥 78.2 kg·hm?2，P2O581.0 kg·hm?2，K2O 75.0 kg·hm?2）。小區面積為 400 m2，各小區間隔50 cm，每個處理3次重復。有機肥由牛糞和雞糞混合堆腐而成，氮含量為0.69%，P2O5含量為0.65%，K2O為0.38%。氮肥為尿素（N，46.4%），磷肥為過磷酸鈣（P2O5，12%），鉀肥為硫酸鉀（K2O，50%）。每年 9月底玉米收獲后，有機肥和磷鉀肥全部作基肥和氮肥 60%作基肥在冬小麥播種時一次性施入，在小麥拔節期追施40%氮肥。6月初小麥收獲后，有機肥和磷鉀肥全部作基肥和氮肥 60%作基肥在夏玉米播種時一次性施入，玉米小喇叭口期追施40%氮肥。其他田間管理同一般大田生產。種植制度為典型的冬小麥-夏玉米輪作。

2019年9月底在玉米收獲期采集土壤樣品。用直徑為5 cm土鉆，在每個小區內按照“S”型取樣法選取5個點，采集0—20 cm土壤樣品，用冰盒帶回實驗室。去除根系、凋落物和其他雜質，將土壤樣品分成兩份，一份于?20 ℃冷凍保存，用于土壤微生物和速效養分分析；另一份土樣室內自然風干，用于其他土壤理化性質測定。

1.3 土壤理化性質測定

土壤 pH 采用玻璃電極法（水土比為 2.5?1），土壤有機碳測定采用重鉻酸鉀外加熱法，土壤全氮采用凱氏定氮法，土壤全磷采用鉬銻抗比色法，土壤銨態氮和硝態氮含量采用 2 mol·L?1氯化鉀溶液提取-流動分析儀（AA3，德國）測定，土壤速效磷采用碳酸氫鈉提取-鉬銻抗比色法（鮑士旦，2000）。土壤微生物量碳、氮采用氯仿熏蒸-K2SO4提取法測定（吳金水等，2006）。

1.4 土壤DNA提取、PCR擴增及MiSeq測序

土壤DNA提取采用Power Soil? DNA Isolation Kit試劑盒提取，稱取0.5 g土樣，提取步驟按試劑盒說明書進行。提取后的土壤總DNA用質量分數為 1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，使用超微量分光光度計（NanoDrop 2000，德國）進行質檢。采用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒對提取的DNA進行精確定量，以確定PCR反應加入的DNA量。采用巢式PCR進行擴增，第一輪引物為cbbL-F（GACTTCA CCAAAGACGACGA）和cbbL-R（TCGAACTTGA TTTCTTTCCA），第二輪引物為cbbL-F（ACCAYCA AGCCSAAGCTSGG）和cbbL-R（GCCTTCSAGCTT GCCSACCRC）。使用梯度PCR儀（Eppendorf，德國）進行PCR產物的擴增。采用25 μL擴增反應體系，包含 12.5 μL 2×Taq Plus Master Mix，3 μL BSA（2 ng·μL?1），1 μL 正向引物（5 μM），1 μL 反向引物（5 μM），2 μL 模板 DNA和 5.5 μL ddH2O。第一輪擴增：94 ℃ 5 min，30 個循環（94 ℃ 30 s，52 ℃30 s，72 ℃ 60 s），最后72 ℃延長7 min。第二輪擴增：94 ℃ 5 min，20個循環（94 ℃ 30 s，52 ℃30 s，72 ℃ 60 s），最后72 ℃延長7 min。每個樣本3個重復，將同一樣本的PCR產物混合后，用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收 PCR產物，Tris-HCl緩沖液洗脫，質量分數為2%的瓊脂糖電泳檢測。使用Qubit 2.0熒光定量系統測定回收產物濃度，將等摩爾濃度的擴增子匯集到一起，混合均勻后進行測序。

1.5 高通量測序數據分析

測序由北京奧維森基因科技有限公司完成，利用Illumina MiSeq PE300平臺上機測序。下機數據經過Trimmomatic和Flash軟件預處理，去除低質量reads，然后根據PE數據之間overlap關系將成對的 reads拼接成一條序列。去除 tags兩端的barcode序列及引物序列，去除嵌合體及其短序列等后得到高質量的 clean tags，拼接過濾后的 clean tags，在0.97相似度下利用Qiime和Vsearch軟件進行可操作分類單元（Operational taxonomic unit，OTU）聚類分析。對比 GreenGenes數據庫，對每個OTU進行物種注釋。α多樣性是對單個樣品物種多樣性的分析，基于OTU的結果，計算Chao1指數、觀測值指數（Observed species）、譜系多樣性指數（phylogenetic diversity，PD whole tree）和香農指數（Shannon）來進行生物多樣性分析。

1.6 數據分析

應用SPSS 19.0統計軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），利用韋恩圖比較樣本間 OTU相似性，利用主成分分析（principal component analysis，PCA）比較不同處理土壤固碳細菌群落的差異，利用CANOCO 4.5軟件對土壤固碳細菌優勢菌屬水平相對豐度與土壤化學性質冗余分析（redundancy analysis，RDA）。

2 結果與分析

2.1 不同施肥措施下土壤化學性質變化

長期不同施肥改變了土壤化學性質（表1）。5種施肥處理的pH值均顯著低于對照A0（P<0.05）。A1、A2、A3和A4的總有機碳含量顯著高于對照A0，A5的總有機碳含量顯著低于對照A0（P<0.05）。5種施肥處理的土壤全氮和硝態氮含量均顯著高于對照（P<0.05）。A2、A3和A5處理的銨態氮含量顯著高于對照（P<0.05），A1和A4處理的銨態氮含量與對照 A0無顯著差異（P>0.05）。A1、A2、A3和 A4的全磷和微生物量氮含量顯著高于對照A0（P<0.05），A5的全磷、微生物量碳和微生物量氮含量與對照A0無顯著差異（P>0.05）。

表1 不同施肥措施下土壤化學性質Table 1 Soil chemical properties in different fertilization treatments

2.2 不同施肥措施下土壤固碳細菌群落多樣性

α多樣性主要關注均勻生境下的物種數目（劉茗等，2021），適合本研究土壤固碳細菌多樣性的描述。Chao1、Observed species和PD whole tree指數均可反映樣品中群落的豐富度，其值越大表明樣品中固碳細菌群落物種的豐富的越高。Shannon指數表示群落多樣性，其值越大表明固碳細菌群落多樣性越高。由圖1可知，A1、A2、A3和A4處理的Chao1、Observed_species指數高于對照A0，A5處理的Chao1、Observed_species指數低于對照A0，但各處理間均無顯著差異（P>0.05）。各處理的PD_whole_tree指數均無顯著差異。A1和A3處理的 Shannon指數高于對照 A0，A4和 A5處理的Shannon指數低于對照 A0但各處理間均無顯著差異（P>0.05）。土壤固碳細菌α多樣性與土壤化學因子的相關性分析結果見表2。土壤固碳細菌Shannon指數與pH呈顯著正相關（P<0.01），與土壤硝態氮含量呈極顯著負相關（P<0.01）。表明影響土壤固碳細菌Shannon多樣性指數的主要土壤環境因子是土壤pH和硝態氮含量。

表2 土壤固碳細菌群落α多樣性與土壤化學因子之間的相關分析Table 2 Correlation analysis between soil CO2-assimilating bacterial α-diversity index and soil chemical properties

圖1 不同施肥措施下土壤固碳細菌群落多樣性Figure 1 Community diversity of CO2-assimilating bacteria in different fertilization treatments

2.3 不同施肥措施下土壤固碳細菌群落組成及相對豐度

在97%序列相似度水平下有12798個OTU，每個樣品的OTU數量從504—575個不等。研究所得序列主要被歸為3個門、4個綱和18個屬。不同施肥措施下土壤固碳細菌群落在門、綱、屬水平上的組成及相對豐度見圖2。以門作為分類學水平，變形菌門Proteobacteria為cbbL微生物優勢菌，各處理相對豐度92.83%—94.98%。A1、A2和A3處理的變形菌門相對豐度與對照A0相比無顯著差異，A4和A5處理顯著降低了變形菌門的相對豐度。以綱作為分類學水平，優勢菌綱為γ-變形菌綱Gammaproteobacteria、α-變形菌綱 Alphaproteobacteria和β-變形菌綱Betaproteobacteria，相對豐度分別為 53.75%—65.80%、16.46%—25.89%和12.28%—18.54%。與對照A0相比，A2、A3、A4和A5處理顯著降低了γ-變形菌綱相對豐度；A1處理的γ-變形菌綱相對豐度低于A0處理，但無顯著差異。α-變形菌綱相對豐度，A2、A4和A5顯著高于A0，A1和A3與A0無顯著差異。β-變形菌綱相對豐度，A3顯著高于 A0，A5顯著低于A0，A1、A2和A4與A0無顯著差異。

圖2 不同施肥措施下土壤固碳細菌群落在門（a）、綱（b）、屬（c）水平上的組成及相對豐度Figure 2 Soil CO2-assimilating bacteria community composition and relative abundance at phylum (a), class (b)and genus (c) level with different fertilization treatments

以屬作為分類學水平，各處理均大于 2%的優勢菌屬有堿湖生菌屬Alkalilimnicola（14.12%—19.34%）、堿螺菌屬Alkalispirillum（6.91%—14.54%）、Brevirhabdus（4.18%—14.95%）、紅桿菌屬Rhodobacter（6.54%—9.27%）、Sulfurifustis（5.73%—7.03%）、Marichromatium（3.41%—6.32%）、Diploblechnum（ 4.37%—6.41%）、Sulfuricaulis（2.54%—4.91%）和Thioalkalivibrio（2.87%—6.03%）。與對照A0相比，A1、A2、A3、A4和A5處理顯著降低了Alkalispirillum和Thioalkalivibrio相對豐度，顯著提高了Brevirhabdus相對豐度。A1、A2、A3、A4、A5處理的Sulfurifustis、Marichromatium和Sulfuricaulis相對豐度與對照A0相比均無顯著差異。

2.4 不同施肥措施下土壤固碳細菌群落組間差異

PCA分析是指運用方差分解的方法，將不同數據組的差異反映在二維坐標圖上，如果兩個處理距離越近，則表示這兩個樣品的組成越相似。不同施肥處理之間有顯著差異OTUs豐度的PCA圖如圖3所示，前兩個主成分分別占細菌群落變異的31.36%和13.71%。A3、A4、A5位于主成分1右側，而對照A0、A1和A2位于主成分1左側。表明，A3、A4和A5處理有顯著差異OTUs豐度組成相似，而A0、A1和A2處理有顯著差異OTUs豐度組成相似。5個施肥處理差異OTUs與對照處理差別顯著，且A3、A4和A5處理與對照A0、A1和A2處于不同排序區。說明連續 10年常量化肥配施有機肥、氮肥增量配施有機肥和單施化肥處理對土壤固碳細菌群落產生了顯著影響。

圖3 不同施肥處理固碳細菌群落結構的主成分分析Figure 3 Principal components analysis of the soil CO2-assimilating bacteria community structure in different fertilization treatments

2.5 固碳細菌群落結構與土壤理化因子的冗余分析

為進一步分析不同土壤理化因子對土壤固碳細菌群落結構的影響，選取土壤具有代表性的優勢菌屬（相對豐度平均值大于 2%）為物種變量、土壤理化性質為環境變量進行冗余分析（圖4）。結果表明，第一排序軸和第二排序軸分別解釋了76.9%和11.2%的變異，前兩軸共解釋了固碳細菌群落總變異的88.1%。第一排序軸與土壤pH呈正相關，與有機碳、全氮、全磷、銨態氮、硝態氮、微生物量碳和微生物量氮呈負相關；第二排序軸與有機碳、全氮、全磷、硝態氮、微生物量碳和微生物量氮呈正相關，與 pH、銨態氮呈負相關。土壤 pH（F=9.969，P=0.002）、全氮（F=10.775，P=0.002）、全磷（F=8.160，P=0.004）、硝態氮（F=21.608，P=0.002）、銨態氮（F=7.598，P=0.002）、微生物量碳（F=14.063，P=0.002）、微生物量氮（F=5.631，P=0.010）對土壤固碳細菌屬水平達到顯著影響，有機碳（F=3.124，P=0.062）對土壤固碳細菌屬水平未達到顯著影響。

圖4 土壤固碳細菌群落結構與土壤化學性質間的冗余分析Figure 4 Redundancy analysis between CO2-assimilating bacteria community structure and soil chemical properties

3 討論

本研究利用Illumina MiSeq PE300高通量測序技術分析華北農田土壤固碳細菌多樣性發現，長期單施化肥和氮肥增量配施有機肥的Shannon多樣性指數低于不施肥對照。這與Qin et al.（2021）對貝加爾針茅草原長期高氮添加試驗研究結果一致。Zhao et al.（2018）研究表明，土壤中高含量的有效氮會增加固碳微生物多樣性。本研究結果與這一研究結論不一致。這可能是因為高氮添加導致土壤中可利用性氮素含量增多，導致喜氮微生物生長迅速。相關性分析表明，土壤固碳細菌Shannon多樣性指數與硝態氮含量呈極顯著負相關性，也說明了這一點。Huang et al.（2018）研究表明，水稻田土壤有效氮含量與cbbL細菌豐度有顯著相關性。施肥對cbbL基因豐度的影響與種群變化規律不完全一致，與不施肥對照相比，單施有機肥、單施化肥及有機肥與化肥配施均可以提高OUTs豐度，特別是單施有機肥物種豐度最高。這是由于肥料施用后，土壤中的營養元素含量增加，土壤pH下降，土壤養分的有效性提高，為土壤中自養固碳細菌提供了所需的營養元素以及豐富的碳源和能源。Zhou et al.（2019）研究發現，連續28年氮添加試驗，固碳微生物多樣性與氮素添加量呈顯著正相關關系。由于陸地生態系統環境異質性，因而不同環境中土壤固碳微生物多樣性對不同氮添加水平、氮添加年限、地上植物群落組成的響應不一致。

不同長期施肥措施對土壤固碳細菌群落結構產生了顯著的影響。本研究中所獲得優勢菌門為變形菌門，變形菌門在土壤中占最大比例，這與其他研究結論一致（Zhou et al.，2019；劉瓊等，2017；蘇鑫等，2020）。本研究發現，與不施肥對照相比，氮肥增施配施有機肥和單施化肥顯著降低了變形菌門相對豐度，A1、A2、和A3處理的變形菌門相對豐度無顯著變化。本研究中γ-變形菌綱Gammaproteo bacteria為土壤中的優勢綱，這與蘇鑫等（2020）在松嫩平原鹽堿耕地研究結果一致。這可能是由于γ-變形菌綱細菌噬鹽微生物較多，而本研究試驗區土壤pH在8.19—8.71之間，適宜該微生物群落生長。本研究中，氮肥增量配施化肥和單施化肥處理顯著提高了α-變形菌綱 Alphaproteo bacteria相對豐度。戴雅婷等（2017）研究也表明，在植被修復和長期施肥過程中α-變形菌綱的豐度不斷上升。

本研究發現不同施肥處理的土壤固碳細菌群落差異顯著，A1、A2、A3、A4和A5處理土壤固碳細菌群落結構與對照A0發生了顯著變化，說明連續 10年施肥改變土壤固碳細菌生境條件，從而引起微生物群落結構的變化。常量化肥配施有機肥、氮肥增量配施有機肥和單施化肥處理的與不施肥對照、單施有機肥和氮肥減量配施有機肥之間差異顯著。RDA分析可直接清楚的反應土壤環境因子對研究區土壤固碳細菌群落特征的影響。從 RDA結果判斷驅動土壤固碳細菌變化的因子發現，土壤固碳微生物群落結構受pH、全氮、全磷、銨態氮、硝態氮、微生物量碳和微生物量氮含量的顯著影響。pH可以通過 H+濃度改變土壤中營養元素的形態從而影響自養微生物類群（Stockdale et al.，2002；劉瓊等，2017）。本研究發現，土壤有機碳對土壤固碳細菌群落結構無顯著影響，這與Xiao et al.（2014）和劉瓊等（2017）對水稻田的研究結果不一致。碳同化微生物對土壤特性和環境因子變化敏感，不同研究者研究結論不一致，推測可能是由于作物類型、土壤質地和施肥量不同造成的（Yuan et al.，2012；劉瓊等，2017）?？梢姡袡C碳對土壤固碳微生物的調控機制并不具有普遍性。本研究表明，有機肥和無機肥連續施用引起土壤 pH和養分變化是土壤固碳微生物群落和多樣性變化的重要原因。不同施肥措施使得土壤環境養分發生了改變影響了對環境變化敏感的自養微生物的生長和代謝活動，從而導致了碳同化功能微生物種群結構的變化。

4 結論

（1）連續 10年過量施用氮肥配施有機肥和單施化肥處理降低了土壤固碳細菌Shannon多樣性指數。土壤pH和硝態氮含量是影響土壤固碳細菌群落α多樣性重要因素。

（2）連續 10年不同施肥措施下，華北平原農田土壤固碳細菌優勢菌群相對豐度發生改變，這種改變在門、綱和屬分類水平上均有體現。單施有機肥、氮肥減量配施有機肥未顯著改變土壤固碳細菌群落結構，常量化肥配施有機肥、氮肥增量化肥配施有機肥和單施化肥顯著改變土壤固碳細菌群落結構。

（3）連續 10年不同施肥措施下，顯著改變了土壤理化因子，這些土壤環境因子的變化進一步影響了土壤固碳細菌群落結構，其中 pH、全氮、全磷、銨態氮、硝態氮、微生物量碳和微生物量氮含量的差異是影響固碳微生物群落特征形成的主要影響因子。