益生菌聯合不同強度有氧運動對2型糖尿病大鼠骨骼肌腦源性神經營養因子、NF-κB及腎臟脂體比、脂肪量的影響

馬丁　盧富琨　熊小芹　馬昌軍

【摘要】 目的：探討益生菌聯合不同強度有氧運動對2型糖尿病大鼠骨骼肌腦源性神經營養因子（BDNF）、核因子-κB（NF-κB）、腎臟脂體比、脂肪量的影響。方法：選取60只清潔級雄性C57/BL大鼠，造模成功后將2型糖尿病大鼠采用隨機數字表法分為五組，分別為模型組、A組（益生菌）、B組（益生菌+運動A強度）、C組（益生菌+B強度）、D組（益生菌+C強度）。A組、B組、C組、D組每日灌胃嗜酸乳桿菌1 mL（益生菌數量為1×10 CFU/mL），B組、C組、D組都給予跑臺有氧運動訓練，分別按10、20、40 m/min速度進行跑臺訓練，每天訓練1 h。五組大鼠治療觀察時間為8周。比較五組大鼠的血糖、胰島素抵抗水平、腎臟脂肪量和脂體比、白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、BDNF、NF-κB水平。結果：治療4、8周，A組、B組、C組、D組的空腹血糖與胰島素抵抗水平均低于模型組，且D組均低于A組、B組、C組，C組均低于B組、A組，B組均低于A組，差異均有統計學意義（P<0.05）。治療8周，A組、B組、C組、D組的腎臟脂肪量和脂體比、血清IL-1β、TNF-α含量、腓腸肌BDNF與NF-κB蛋白相對表達水平均低于模型組，且D組均低于A組、B組、C組，C組均低于B組、A組，B組均低于A組，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論：益生菌聯合不同強度有氧運動在2型糖尿病大鼠中應用，能抑制腓腸肌BDNF與NF-κB蛋白的表達，還可抑制血清炎癥因子的釋放，從而改善大鼠的血糖與腎臟脂體比、脂肪量。

【關鍵詞】 益生菌 有氧運動 2型糖尿病 腓腸肌 腦源性神經營養因子 核因子-κB

Effect of Probiotics Combined with Different Intensities of Aerobic Exercise on Skeletal Muscle Brain-derived Neurotrophic Factor， NF-κB， and Renal Lipid-to-body Ratio and Fat Mass in Type 2 Diabetic Rats/MA Ding， LU Fukun， XIONG Xiaoqin， MA Changjun. //Medical Innovation of China， 2022， 19（14）： 024-028

[Abstract] Objective： To investigate the effects of probiotics combined with different intensities of aerobic exercise on skeletal muscle brain-derived neurotrophic factor （BDNF）， nuclear factor-kappa B （NF-κB）， and renal lipid-to-body ratio and fat mass in skeletal muscle of type 2 diabetic rats. Method： A total of 60 clean-grade male C57/BL rats were selected， after modeling they were randomly divided into 5 groups， model group， group A （probiotics）， group B （probiotics + exercise intensity A）， group C （probiotics +exercise intensity B）， and group D （probiotics + exercise intensity C）. Group A， group B， group C and group D were given 1 mL lactobacillus acidophilus （probiotics amount was 1×10 CFU/mL） by intragastric administration. Group B， C and D were given treadmill aerobic exercise training at 10， 20 and 40 m/min， respectively， for 1 h every day. The rats in the five groups were treated for 8 weeks. The levels of blood glucose， insulin resistance， renal lipid-to-body ratio and fat mass， interleukin-1β（IL-1β）， tumor necrosis factor-α（TNF-α）， BDNF and NF-κB were compared among five groups. Result： After 4 and 8 weeks of treatment， the levels of fast blood glucose and insulin resistance in the group A， group B， group C and group D were lower than those in the model group， and those in the group D were lower than those in the group A， group B and group C， those in the group C were lower than those in the group B and group A， and those in the group B were lower than those in the group A， the differences were statistically significant （P<0.05）. After 8 weeks of treatment， the kidney fat content， lipid-to-body ratio， serum IL-1β and TNF-α contents， and the relative expression level of BDNF and NF-κB protein in gastrocnemius muscle in the group A， group B， group C and group D were lower than those in the model group， and those in the group D were lower than those in the group A， group B and group C， those in the group C were lower than those in the groups B and group A， and those in the group B were lower than those in the group A， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion： The application of probiotics combined with different intensities of aerobic exercise in type 2 diabetic rats can inhibit the expression of gastrocnemius muscle BDNF and NF-κB protein， and can also inhibit the release of serum inflammatory factors， thereby promoting the improvement of blood sugar and renal lipid-to-body ratio and fat mass in rats.

[Key words] Probiotics Aerobic exercise Type 2 diabetes Gastrocnemius muscle Brain-derived neurotrophic factor Nuclear factor-κB

First-author’s address： Bazhong Central Hospital， Sichuan Province， Bazhong 636000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.14.006

當前糖尿病的發病率逐年增加，特別是在我國，發病人數已超億人，已成為重要的醫學和公共衛生問題。2型糖尿病為糖尿病的主要類型，占80.0%以上。運動可提高胰島素的敏感性和作用效果，這使得運動成為治療2型糖尿病的主要非藥物手段[1]。有研究發現有氧運動改善血糖代謝的效果優于無氧運動，而無氧運動改善血脂代謝的效果優于有氧運動[2-3]。現代研究表明，腸道菌群的失衡與糖尿病的發生與發展有著密切的關系，鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌等部分益生菌能在改善腸道微生態平衡的同時改善機體的胰島素抵抗，降低體內促炎性因子，從而改善糖尿病患者的臨床癥狀[4-5]。腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）在骨骼肌、神經組織中均廣泛存在，特別是BDNF可通過旁分泌的作用形式調節胰腺β細胞活性，還可激活AMPK/CREB/PGC-1α信號通路，參與血糖代謝，并促進脂肪代謝[6]。核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）是炎癥級聯反應的重要啟動因素，其活化可產生大量炎癥因子，引起骨骼肌萎縮，導致骨骼肌炎癥反應，也可參與調節血糖代謝[7-8]。本文具體探討了益生菌聯合不同強度有氧運動對2型糖尿病大鼠骨骼肌BDNF、NF-κB及腎功能的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選取60只清潔級雄性C57/BL大鼠，3周齡，體質量200～210 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，實驗動物所有喂養程序與實驗處理過程由巴中市中心醫院實驗動物中心管理。飼養條件：飼養與實驗過程環境穩定，大鼠攝食、進水，12 h︰12 h燈光進行白天與晝夜循環，相對濕度（55±5）%，室溫（25±2）℃。鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（生產廠家：美國Sigam公司，貨號：S0130，規格：1 g/瓶），益生菌-嗜酸乳桿菌（lactobacillusacidophilus，HCCB20535）（生產廠家：通化金馬藥業集團股份有限公司，國藥準字：H10940114，規格：0.5 g/片），抗BDNF抗體、抗NF-κB抗體購自Epitomics公司，生化分析儀購自NeoBioscience公司，白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）與腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒購自大連Takara公司，HRP標記山羊抗兔抗體購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。本研究經本院動物倫理和使用委員會審批。

1.2 方法 （1）2型糖尿病大鼠模型的建立。所有大鼠適應性喂養1周后進行適應性訓練，通過高脂高糖飲食喂養8周后，采用一次性小劑量鏈脲佐菌素，稱取鏈脲佐菌素適量，加入生理鹽水使溶解，配制成濃度為30 mg/kg，腹腔注射1 mL誘導模型。高脂高糖飼料配方：44.0%糖、16.0%蛋白質、40.0%脂肪。造模成功標準：鏈脲佐菌素注射后第5天禁食12 h后尾靜脈取血，測定葡萄糖含量，空腹血糖≥11.1 mmol/L判定為建立2型糖尿病大鼠模型成功，本次研究所有大鼠都造模成功。（2）將2型糖尿病大鼠采用隨機數字表法分為五組，分別為模型組、A組（益生菌）、B組（益生菌+運動A強度）、C組（益生菌+B強度）、D組（益生菌+C強度）。A組、B組、C組、D組每日灌胃嗜酸乳桿菌，分別稱取嗜酸乳桿菌適量，加入生理鹽水使溶解，配制成濃度為益生菌數量為1×109 CFU/mL，均給藥1 mL，模型組灌胃等劑量的純凈水，每天給藥1次。B組、C組、D組都給予跑臺有氧運動訓練，分別按10、20、40 m/min速度進行跑臺訓練，每天訓練1 h，A組與模型組不給予針對性跑臺有氧運動訓練。五組大鼠治療觀察時間為8周。

1.3 觀察指標 （1）比較五組大鼠治療前和治療4、8周的空腹血糖和胰島素抵抗水平。（2）比較五組大鼠腎臟脂肪量和脂體比。所有大鼠在治療8周后處死，取腎臟脂肪組織進行稱重，脂肪量=腎周脂肪+腎膜脂肪;脂體比（%）=（腎周脂肪+腎膜脂肪）/體重×100%。（3）比較五組大鼠治療8周的IL-1β、TNF-α含量。取處死大鼠的眼底動脈血1 mL左右，3 000 r/min離心，10 min，分離血清，采用酶聯免疫法檢測血清IL-1β、TNF-α含量。（4）比較五組大鼠治療8周的腓腸肌BDNF和NF-κB水平。取處死大鼠的腓腸肌，剪碎研磨后提取總蛋白，定量蛋白濃度后進行上樣電泳、轉膜和封閉，加入抗BDNF抗體和抗NF-κB抗體，孵育后再加入二抗，采用發光法顯影得到Western blot條帶，計算相對表達水平。

1.4 統計學處理 采用SPSS 25.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗，多組間對比為單因素方差分析（One-Way ANOVA），以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 五組大鼠血糖與胰島素抵抗水平比較 治療4、8周，A組、B組、C組、D組的空腹血糖與胰島素抵抗水平均低于模型組，且D組均低于A組、B組、C組，C組均低于B組、A組，B組均低于A組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.2 五組治療8周的腎臟脂肪量與脂體比比較 治療8周，A組、B組、C組、D組的腎臟脂肪量與脂體比均低于模型組，且D組均低于A組、B組、C組，C組均低于B組、A組，B組均低于A組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.3 五組血清IL-1β、TNF-α含量比較 治療8周，A組、B組、C組、D組的血清IL-1β、TNF-α含量均低于模型組，且D組均低于A組、B組、C組，C組均低于B組、A組，B組均低于A組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表3。

2.4 五組腓腸肌BDNF與NF-κB蛋白相對表達水平比較 治療8周，A組、B組、C組、D組的腓腸肌BDNF與NF-κB蛋白相對表達水平均低于模型組，且D組均低于A組、B組、C組，C組均低于B組、A組，B組均低于A組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表4。

3 討論

2型糖尿病已成為全國乃至全球性的健康問題，藥物治療能夠有效降低血糖水平，但是需要長期用藥，且部分患者容易產生耐藥及腸功能紊亂等副作用，為此在臨床上需要合理選擇非藥物治療方法[9]。益生菌除了具有改善胃腸功能的作用外，還具有降低血糖的作用。有研究顯示，益生菌能有效增強機體的口服糖耐量，降低餐后血糖濃度。同時益生菌還可預防2型糖尿病患者非致病性大腸桿菌向組織黏附與轉移，避免病情的惡化[10]。本研究顯示治療4、8周，A組、B組、C組、D組的血糖與胰島素抵抗水平均低于模型組，且D組均低于A組、B組、C組，C組均低于B組、A組，B組均低于A組（P<0.05）。治療8周，A組、B組、C組、D組的腎臟脂肪量與脂體比均低于模型組，且D組均低于A組、B組、C組，C組均低于B組、A組，B組均低于A組（P<0.05），表明益生菌聯合有氧運動在2型糖尿病大鼠的應用能改善血糖，降低腎臟脂肪量與脂體比。當前也有研究表明，運動可提高胰島素的敏感性和作用效果，可減少胰島素抵抗，加快糖、脂氧化分解，促進糖原合成，從而降低血糖水平。特別是有氧運動可通過增加肌肉中葡萄糖轉運蛋白4含量和改善胰島素敏感性等機制，增加骨骼肌對葡萄糖攝取能力，進而起到調控血糖的作用[11-12]。

糖尿病患者體內長時間高血糖狀態會促使葡萄糖發生糖化反應，可以毒傷神經元，造成患者病情惡化。益生菌不但能明顯減少肝糖原的積累，還能夠改善大鼠糖耐量受損，從而在一定程度上降低胰島素水平[13]。還有研究顯示益生菌能有效控制攝入高果糖大鼠體重的增加，改善高胰島素血癥大鼠高胰島素水平，降低大鼠空腹胰島素水平，提高口服耐糖能力[14]。本研究顯示治療8周，A組、B組、C組、D組的血清IL-1β、TNF-α含量均低于模型組，且D組均低于A組、B組、C組，C組均低于B組、A組，B組均低于A組（P<0.05），表明益生菌聯合有氧運動在2型糖尿病大鼠的應用能抑制炎癥因子的釋放。從機制上分析，IL-1β、TNF-α的大量釋放可導致骨骼肌炎癥反應，影響骨骼肌能量代謝，引起骨骼肌萎縮[15]。有氧運動能明顯改善糖尿病大鼠的糖脂代謝，能抑制糖尿病大鼠骨骼肌AGE-RAGE軸通路，降低其氧化應激和炎癥反應，減輕骨骼肌損傷，改善血糖代謝[16-17]。

BDNF主要表達在神經系統組織中，參與調節調控神經元再生和突觸可塑性、神經損傷修復等過程。BDNF也存在于骨骼肌、血管等組織中，具有改善骨骼肌胰島素抵抗、提高骨骼肌細胞脂肪氧化能力、調節肌纖維類型分化等作用。抑制骨骼肌中BDNF的表達，可激活AMPK/CREB/PGC-1α信號通路，減少胰島素抵抗和骨骼肌萎縮，促進脂質氧化。NF-κB是糖尿病骨骼肌炎癥反應中重要的調節因子，其活化后可導致骨骼肌萎縮和胰島素抵抗，將啟動和調節炎癥因子的轉錄，參與骨骼肌炎癥反應。本研究顯示治療8周，A組、B組、C組、D組的腓腸肌BDNF與NF-κB蛋白相對表達水平均低于模型組，且D組均低于A組、B組、C組，C組均低于B組、A組，B組均低于A組（P<0.05），表明益生菌聯合有氧運動在2型糖尿病大鼠的應用能抑制腓腸肌BDNF與NF-κB蛋白的表達。當前有研究表明有氧運動可抑制糖尿病大鼠骨骼肌中BDNF的表達，提高脂肪氧化水平，進一步激活AMPK/CREB/PGC-1α信號通路，調節血脂代謝[18-19]。同時其能更好地抑制骨骼肌中NF-κB蛋白的表達，提高骨骼肌糖代謝能力，降低骨骼肌炎癥和肌萎縮。本研究由于經費限制，沒有對其他動物模型進行分析，也沒有設置空白組，將在后續研究中探討。

綜上所述，益生菌聯合不同強度有氧運動在2型糖尿病大鼠的應用能抑制腓腸肌BDNF與NF-κB蛋白的表達，還可抑制血清炎癥因子的釋放，從而促進改善大鼠的血糖與脂體比、脂肪量。

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（收稿日期：2021-11-19） （本文編輯：張明瀾）