KU60019抑制ATM對HepG2細胞輻射旁效應的調控

顏宇龍， 萬丹婷， 周潔， 朱子豪， 鄧蒸蒸， 黃波

(南華大學衡陽醫學院公共衛生學院，湖南省衡陽市 421001)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球范圍內第五大常見腫瘤，在中國，肝細胞癌的發病率排在腫瘤發病率中第4位，病死率排第2位，且近80%患者癥狀晚期才發現[1]。目前肝細胞癌的治療方法有肝移植、靶向藥物治療、手術切除、放療和局部消融等。在患者腫瘤細胞進行放療同時也能對周圍正常細胞或組織產生的損傷為輻射旁效應[2](the radiation-induced bystander effect,RIBE)。RIBE主要通過細胞縫隙鏈接(Gap junction intercellular communication,GJIC)、活化細胞因子參與自噬、外泌體等三大途徑發揮損傷作用，能導致基因不穩定、炎癥反應、DNA損傷、細胞凋亡、細胞生長異常等生物學效應[3]。共濟失調毛細血管擴張癥突變(ataxia-telangiectasia mutated,ATM)基因能識別DNA損傷位點，輻射損傷可活化ATM來識別和修復DNA損傷[4]。KU60019是一種ATM激酶特異性的抑制劑，是高度有效的放射增敏劑。本研究探討ATM在輻射旁效應中的調控作用及機制，為肝細胞癌放療提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

人肝細胞癌細胞(HepG2)由中國軍事醫學科學院周平坤研究員惠贈。DMEM培養基購自Gibco公司(USA)；MTT、羅丹明B、Giemsa染液購自北京索萊寶科技有限公司；137Cs γ射線生物細胞輻照儀(型號為HXFS-IA)購自中國核動力原設備制造廠。活性氧(reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染凋亡檢測試劑盒購自南京Vazyme生物科技有限公司。

1.2 輻射旁效應細胞模型的構建

137Cs γ射線生物細胞輻照儀照射HepG2細胞，劑量率為133.3 cGy/min，輻照總劑量為8 Gy。通過刺激液模式構建輻射旁效應模型，8 Gy輻照1 h后收集細胞培養液，1 000 r/min離心5 min，收集上清，用0.22 μm過濾頭過濾后構成條件培養基，將條件培養基加入到未受輻照細胞中，共同培養1 h。

1.3 實驗分組及處理

實驗分為空白組(NC組)、輻射旁效應組(ICM組)、輻射旁效應+KU60019組(聯合組)及單純輻照組(IR組)。NC組不做任何處理，新鮮普通培養基培養；ICM組于1.2構成的旁效應培養基中培養；聯合組培養液為旁效應培養基中加入KU60019,使含KU60019旁效應培養基的終濃度為7 μmol/L；IR組于新鮮普通培養基培養時單純8 Gy輻照處理。

1.4 MTT檢測細胞存活率

將HepG2細胞以3.0×104個/mL接種于96孔板中，待細胞貼壁，各組實驗處理后培養24、48、72 h后，每孔加入10 μL MTT以及90 μL培養基，于37 ℃培養箱中孵育4 h，棄上清，每孔加入110 μL Formazan溶液，室溫下振蕩儀振蕩10 min，酶聯免疫檢測儀測定490 nm波長處的光密度(OD)，分析各組細胞存活率。

1.5 細胞生長曲線實驗檢測細胞增殖

將HepG2細胞以5.0×103個/mL接種于24孔板中，各組完成實驗處理后，每3天更換相應的培養液，每隔24 h計數一次，連續計數7天。

1.6 細胞內SOD活力、MDA含量、ROS水平的測定

將HepG2細胞以2.0×105個/mL水平接種于6 cm皿中，完成各組處理因素48 h后收集細胞。提取蛋白，酶標儀490 nm處用BCA法測定各處理組樣品蛋白的水平。按照試劑盒說明書檢測細胞內SOD活力、MDA含量、ROS水平。

1.7 熒光分光光度法檢測線粒體膜電位

按1.6方法收集細胞，1 mL預先4 ℃處理的杜氏磷酸鹽緩沖液(DPBS)重懸細胞，每管加入1 μL羅丹明B，使溶液質量濃度為100 mg/L，避光孵育0.5 h，離心收集細胞，1 mL DPBS重懸細胞，熒光分光光度計檢測各組細胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)。最佳激發波長488 nm，發射波長為525 nm。

1.8 流式細胞術檢測細胞的凋亡

按1.6方法收集細胞，離心去上清，加入100 μL的Binding Buffer懸浮細胞，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL Propidium Iodide混勻液孵育5 min，最后加400 μL Binding Buffer混勻，1 h內流式細胞儀檢測。

1.9 統計學分析

2 結 果

2.1 KU60019濃度的確定

以DMSO作為KU60019溶劑，MTT檢測DMSO，1、3、5、7、9 μmol/L KU60019作用于細胞后觀察細胞的存活情況。結果表明，DMSO對細胞存活無明顯影響，24、48、72 h后，7、9 μmol/L KU60019能明顯抑制細胞增殖(P<0.05；圖1)，7 μmol/L KU60019對HepG2細胞毒性較9 μmol/L更小，故后續選用7 μmol/L KU60019進行實驗。

圖1 MTT檢測不同濃度KU60019對細胞存活率的影響a為P<0.05,與0 μmol/L組比較。

2.2 KU60019抑制ATM后降低細胞存活率

ICM組、聯合組、IR組細胞存活率低于NC組(P<0.05)，聯合組、IR組細胞存活率明顯低于ICM組(P<0.05；圖2)。

圖2 KU60019抑制ATM后降低細胞存活率a為P<0.05,與NC組比較;b為P<0.05,與ICM組比較。

2.3 KU60019抑制ATM后降低細胞增殖能力

IR組、聯合組細胞從第5天開始生長緩慢，細胞數明顯低于NC組和ICM組(P<0.05)；ICM組、聯合組、IR組細胞生長能力明顯低于NC組(P<0.05；圖3)。

圖3 KU60019抑制ATM后降低細胞增殖能力a為P<0.05,與NC組比較;b為P<0.05,與ICM組比較。

2.4 KU60019抑制ATM后對細胞內SOD、MDA、ROS的影響

與NC組比較，ICM組、聯合組、IR組細胞內SOD活力下降，MDA含量和ROS水平升高(P<0.05)；與ICM組比較，聯合組、IR組細胞內SOD活力下降，MDA含量和ROS水平升高(P<0.05；表1)。

表1 KU60019抑制ATM后對細胞內SOD、MDA、ROS的影響

2.5 KU60019抑制ATM后降低細胞線粒體膜電位

與NC組比較，ICM組、聯合組、IR組細胞線粒體膜電位降低(P<0.05)；與ICM組比較，聯合組、IR組細胞線粒體膜電位降低(P<0.05；圖4)。

圖4 KU60019抑制ATM后降低線粒體膜電位a為P<0.05,與NC組比較;b為P<0.05,與ICM組比較。

2.6 KU60019抑制ATM后促進細胞凋亡

與NC組比較，ICM組、聯合組、IR組細胞凋亡率增加(P<0.05)；與ICM組比較，聯合組、IR組細胞凋亡率增加(P<0.05；圖5)。

圖5 KU60019抑制ATM后促進細胞凋亡a為P<0.05,與NC組比較;b為P<0.05,與ICM組比較。

3 討 論

目前，放射治療是肝細胞癌治療的主要方法之一，腫瘤細胞有不同程度的輻射抗性，腫瘤細胞生長速度快、增殖能力強，其增殖與凋亡失衡是腫瘤細胞抵抗輻射的重要原因[5-6]。本研究結果表明，當未施加任何處理因素時，空白組肝細胞癌細胞增殖能力強，生長速度快，且均高于其他處理組，IR和輻射刺激液作用后能對HepG2細胞存活產生明顯抑制。ATM是DNA損傷修復治療靶點，正常情況下ATM以無活性的二聚體形式存在，當細胞受到輻射損傷時，ATM可活化介導細胞凋亡與增殖等生物學通路，激活細胞周期檢查點，進行細胞自我損傷修復或導致凋亡發生[7-8]。本研究發現KU60019作用于HepG2細胞抑制ATM蛋白激酶表達后能明顯抑制HepG2細胞存活，且聯合組細胞存活率與增殖能力明顯低于ICM組。這說明KU60019抑制ATM能降低細胞增殖能力，促進細胞凋亡。

氧化應激的介入可介導輻射旁效應，氧化還原穩態是維持細胞正常增殖的重要因素之一，ATM活化后可以降低體內活性氧水平，激活PI3K/Akt信號通路，增強細胞抗氧化損傷能力[9-10]。黃越等[11]發現組織受到損傷后，ATM被活化，能產生ROS、SOD等副產物，導致組織氧化還原系統失衡，發生氧化應激損傷。本文ICM組與IR組較NC組細胞ROS、MDA含量上升，SOD活力下降；當抑制ATM蛋白激酶表達，聯合組較ICM組細胞ROS、MDA含量上升，SOD活力下降，這提示ATM參與此次輻射旁效應氧化損傷過程。

線粒體能調節凋亡信號通路，線粒體內膜含有很多帶有負電荷的糖蛋白，這些糖蛋白可引起線粒體膜電位發生變化[12]，從而細胞色素C可隨膜電位進入細胞，參與細胞凋亡，介導輻射旁效應早期生物效應[13]。本文ICM組與IR組較NC組細胞凋亡率增加，線粒體膜電位下降，聯合組較ICM組細胞凋亡率增加、線粒體膜電位下降。

綜上所述，ATM在輻射損傷調控作用中起到不可替代的作用，抑制ATM蛋白激酶表達，能使細胞對輻射旁效應敏感性增加，氧化還原系統失衡，細胞抗氧化損傷能力降低，能阻礙細胞進行自我損傷修復，使細胞增殖受到抑制，發生凋亡。這為提高肝細胞癌細胞的放射敏感性、進一步闡明輻射旁效應的機制提供了基礎。