RDS合并呼吸機相關性肺炎新生兒肺部菌群多樣性分析

田甜， 韋海林， 陸敦， 陸巖

(河池市婦幼保健院兒科，廣西省河池市547000)

隨著新生兒重癥監護室(neonatal intensive care unit,NICU)技術的不斷完善，新生兒呼吸窘迫綜合征(respiratory distress syndrome,RDS)的搶救效果得到明顯提高，機械通氣等呼吸支持治療能有效改善其臨床癥狀，但也帶來了呼吸機相關性肺炎(ventilator associated pneumonia,VAP)問題，VAP不僅會增加治療時間與費用，還可導致呼吸系統后遺癥[1-3]。了解RDS合并VAP患兒肺部菌群特征，以指導臨床抗生素選擇，對盡早控制感染、改善患兒預后具有重要意義。隨著抗生素的廣泛使用致病菌菌種不斷變遷，為了解近年VAP患兒肺部主要致病菌及菌群多樣性特點，本研究對RDS合并VAP新生兒肺部致病菌分布以及菌群多樣性特征進行了分析，現報道如下。

1 資料和方法

1.1 研究對象

選擇本院2017年1月—2021年1月行氣管插管RDS新生兒70例，根據是否并發VAP分為VAP組(30例)和對照組(40例)。VAP診斷標準參考文獻[4]。納入標準：符合新生兒RDS診斷標準[5]，患兒具有發生RDS的高危因素，臨床有呼吸窘迫相關表現，體格檢查可見胸廓扁平，聽診呼吸音低，偶可聞及細濕啰音，聯合胸部X線片、血氣分析、泡沫試驗即可確診；均參考文獻[6]進行RDS評分。排除標準：排除新生兒濕肺、胎糞吸入、產時窒息致RDS，合并呼吸系統先天發育畸形；合并先天性心臟病。本研究經本院倫理委員會批準，家長知情同意。新生兒RDS評分VAP組高于對照組(P<0.05)，兩組其他臨床資料比較差異無顯著性(P>0.05；表1)。

表1 兩組臨床資料的比較

1.2 細菌分離與鑒定

于患兒機械通氣48 h后，應用抗生素治療前，采集痰液標本，制備痰液震蕩液，接種于哥倫比亞血平板與流感嗜血桿菌分離平板，MicroScan WalkAway-40全自動細菌鑒定/藥敏測試儀鑒定細菌種屬。

1.3 菌群豐度和香農-維納指數的測定

分別于氣管插管第1、2、3、4、5天采集患兒痰液標本。應用細菌微量DNA提取試劑盒提取DNA，PCR擴增反應采用細菌16SrDNA V3區基因片段設計通用引物，引物設計由上海生工公司合成。上游引物5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGG GGCAGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，下游引物5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′。反應體系包括DNA原液6 μL，預混液25 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，ddH2O 18 μL。循環程序94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，72 ℃延伸1 min，共循環10次；94 ℃變性30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃延伸1 min，共循環25次；72 ℃延伸7 min。參考文獻[7]進行DGGE檢測，PCR產物序列為195 bp，采用Decode系統進行DGGE分析。采用Quantity One(BIO-RAD,America)軟件對DGGE條帶數目(豐度)與相似度進行檢測，并將數據導入BIO-DAP軟件計算香農-維納指數[8]。

1.4 統計學方法

2 結 果

2.1 兩組患兒機械通氣和預后情況的比較

VAP組機械通氣時間、拔管后吸氧時間、重復插管上機率、死亡率均高于對照組(P<0.05；表2)。

表2 兩組患兒機械通氣和預后情況的比較

2.2 病原菌分布情況

VAP組30例患兒共檢出36株菌株，以革蘭氏陰性菌為主；檢出率前3位的病原菌分別為肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌和肺炎鏈球菌(表3)。

表3 VAP病原菌分布的情況(n=36) 單位：株(%)

2.3 兩組菌群豐度的比較

兩組患兒菌群豐度均從治療第2天即上升，且在第3～5天時維持較高水平，且VAP組第2～4天菌群豐度低于對照組(P<0.05；表4)。

2.4 兩組香農-維納指數的比較

對照組肺部菌群香農-維納指數從第2天即上升，且在第3～5天維持較高水平，VAP組從第3天開始上升，在第4～5天維持較高水平；且VAP組第2～4天香農-維納指數顯著低于對照組(P<0.05；表5)。

表4 兩組患兒菌群豐度的比較

表5 兩組患兒痰液菌群香農-維納指數的比較

3 討 論

機械通氣等呼吸支持治療可有效改善RDS患兒臨床癥狀，改善患兒預后，但長期使用呼吸機將引起VAP，VAP已成為撤機困難、延長患兒住院時間的主要原因。VAP的發生將增加RDS的治療難度，并增加不良預后發生風險。本研究中70例RDS患者共30例發生VAP，VAP發生率為42.86%。VAP組患兒死亡率遠高于對照組，提示VAP的發生將增加不良預后發生風險，這與謝朝云等[9]研究結論一致。VAP組患兒治療前RDS評分更高、機械通氣時間和拔管后吸氧時間更長，重復插管次數也更多，提示以上因素可能是增加VAP風險的危險因素。

明確VAP常見致病菌，在早期經驗性用藥和改善患兒預后中具有重要意義。本研究采集VAP組患兒痰液行細菌培養發現，VAP組30例患兒中共檢出36株菌株，以革蘭氏陰性菌為主，檢出率排前3位的病原菌分別為肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌和肺炎鏈球菌，鑒于藥敏試驗結果，建議臨床經驗性選擇亞胺培南、環丙沙星等藥物進行治療。

既往研究認為，VAP的發病機制主要包括氣管插管表面細菌吸入或外界環境中病原菌入侵兩方面，且很長一段時間內，肺部被認為是無菌的。隨著研究技術的不斷進展，高通量測序技術不斷促進微生物組學的發展，該認知逐漸被顛覆。16S rRNA是現臨床應用范圍最廣的基因測序技術，可鑒別出不能培養的細菌[10]，Guss等[11]利用16S rRNA技術，在囊性纖維化患者痰液中發現了60多種細菌，提示肺部菌群是一個復雜的微生態系統，且有研究提出，機械通氣患者肺部微生態失衡，正常負反饋機制被破壞，是導致感染的重要原因[12]。彭純穎等[13]研究報道，VAP患兒肺部菌群物種多樣性及豐度均發生明顯改變。基于以上研究，說明RDS合并VAP患兒也可能存在肺部微生態失衡。

本研究借助16S rRNA技術，對VAP患兒肺部菌群多樣性進行研究，并憑借DGGE技術對細菌豐度以及香農-維納指數進行定量。結果提示，氣管插管初期，VAP組患兒及對照組患兒肺部菌群多樣性均較低，而隨著插管時間的不斷延長，兩組肺部菌群多樣性不斷增高，說明隨著插管時間的延長，患兒肺部細菌種類逐漸增多。但在插管治療第2～4天時，感染VAP的患兒肺部菌群豐度明顯低于對照組患兒，說明并發VAP患兒肺部細菌多樣性具有降低趨勢，肺部細菌多樣性下降可能是導致VAP的重要原因。在插管第5天，兩組肺部菌群豐度以及香農-維納指數間差異無顯著性，可能與隨著插管治療時間的延長，部分VAP患兒病情不斷好轉，或VAP患兒對抗生素的耐藥增加，對照組患兒受到抗生素抑制等因素相關[14-15]。

綜上所述，RDS患兒機械通氣過程中VAP發生率高，引起VAP的主要致病菌包括肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌以及肺炎鏈球菌，機械通氣過程中肺部菌群多樣性降低對提示VAP具有重要警示作用。