miR-671-3p靶向調(diào)控CKAP4對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及遷移的影響

莫家鵬， 劉群會(huì)， 章慧， 向春暉

(1.恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北省恩施市445000；2.上海建工醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海市200083；3.恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北省恩施市445000)

腦膠質(zhì)瘤是一種發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常見惡性腫瘤，患者預(yù)后較差[1]。細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白4(cytoskeleton associated protein 4, CKAP4)是人類癌抗原組成成分之一，能夠介導(dǎo)癌癥發(fā)生相關(guān)信號(hào)通路[2-3]。有研究顯示，CKAP4在人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中顯著降低[4]，但關(guān)于CKAP4與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系的報(bào)道較少。近年隨著對(duì)微小RNA(microRNA, miRNA)研究的深入，認(rèn)為miRNA表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)展相關(guān)，可能成為潛在的腫瘤分子標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)[5]。因此，本文對(duì)miR-671-3p是否可靶向調(diào)控CKAP4進(jìn)行了研究，以期為腦膠質(zhì)瘤的分子治療提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料

收集2018年3月—2020年3月本院病理科術(shù)后腦膠質(zhì)瘤組織及配對(duì)癌旁5 cm正常組織標(biāo)本8對(duì)，均符合腦膠質(zhì)瘤病理學(xué)診斷且術(shù)前無(wú)藥物、化學(xué)治療史；術(shù)中液氮冷凍后放入-80 ℃保存，研究方案通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞由武漢普諾賽生命科技有限公司提供。DMEM培養(yǎng)基含10%胎牛血清(fulfillment by store,FBS)。miR-671-3p 陰性對(duì)照(miR-671-3p NC)、miR-671-3p模擬物(miR-671-3p mimic)、miR-671-3p抑制劑(miR-671-3p inhibitor)均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P生物公司。快速定點(diǎn)誘變?cè)噭┖匈?gòu)自Agilent Technologies公司；pGL4熒光素酶載體和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.2 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(5×104個(gè)/孔)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將細(xì)胞分為miR-671-3p NC組、miR-671-3p mimic組、miR-671-3p inhibitor組，分別轉(zhuǎn)染miR-671-3p NC、miR-671-3p mimic和miR-671-3p inhibitor質(zhì)粒。根據(jù)LipofectAMINE 2000轉(zhuǎn)染試劑盒使用說(shuō)明書對(duì)U251細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染結(jié)束后更換新的培養(yǎng)基并開展后續(xù)研究。

1.3 聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)miR-671-3p mRNA表達(dá)

試劑盒提取標(biāo)本組織中總RNA并檢測(cè)其純度，TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此cDNA為模板參照引物和探針序列進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為cDNA模板1 μL，上下游miR-671-3p引物各0.5 μL，SYBR Premix ExTaq 10 μL，加無(wú)核酶水補(bǔ)充至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，45次循環(huán)。根據(jù)擴(kuò)增曲線讀取循環(huán)數(shù)(Ct)，以2ΔΔCt計(jì)算miR-671-3p mRNA含量。

1.4 CCK測(cè)定細(xì)胞增殖能力

接種細(xì)胞于培養(yǎng)板中，每孔加入10 μL CCK-8溶液后培養(yǎng)，3 h后采用酶標(biāo)儀測(cè)定第1、2、3、4、5、6天時(shí)450 nm波長(zhǎng)處光密度(OD)，細(xì)胞增殖率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD/空白組OD)×100%。

1.5 細(xì)胞遷移能力的測(cè)定

細(xì)胞調(diào)整至2×108個(gè)/L，500 μL完全培養(yǎng)液加至Transwell小室下室，200 μL無(wú)血清培養(yǎng)液加至上室內(nèi)，37 ℃孵育24 h，4%多聚甲醛固定，PBS清洗， DAPI染色，制備玻片，封片，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況。

1.6 熒光素酶報(bào)告基因分析

miR-671-3p和CKAP4的結(jié)合位點(diǎn)通過(guò)工具網(wǎng)站Targetscan得到(http://www.targetscan.org/vert_72/)。對(duì)于miR-671-3p和CKAP4靶向的驗(yàn)證，將野生型WT-CKAP4 mRNA的3′-非翻譯區(qū)(UTR)序列擴(kuò)增到pGL4熒光素酶載體的下游位點(diǎn)，并使用快速定點(diǎn)誘變?cè)噭┖猩赏蛔冃蚆UT-CKAP4。使用Lipo2000將pGL4-WT-CKAP4/pGL4-MUT-CKAP4和miR-671-3p mimics或miR-671-3p NC共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染36 h后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性。

1.7 Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中CKAP4表達(dá)水平

細(xì)胞中加入200～300 μL 85 ℃RIPA蛋白裂解細(xì)胞；裂解樣品經(jīng)煮沸、超聲、離心后，取上清液，紫外光譜檢測(cè)定量，-20 ℃分裝保存；將50 μg樣品加入1×SDS凝膠加樣緩沖液，100 ℃變性10 min，順序加樣，行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳；經(jīng)濕式電轉(zhuǎn)儀恒流冰浴轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶4 ℃封閉1 h；分別孵育CKAP4 16686-1-AP 一抗后，在4 ℃過(guò)夜；加入羊抗兔/抗鼠二抗孵育1 h，化學(xué)發(fā)光、顯影、定影，觀察雜交信號(hào)；重復(fù)3次，Image J軟件比較各組細(xì)胞和組織中CKAP4與β-actin灰度值比值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，針對(duì)不同樣本及不同比較模式選擇F檢驗(yàn)、SNK-q檢驗(yàn)、配對(duì)t檢驗(yàn)等；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 人腦膠質(zhì)瘤組織中miR-671-3p、CKAP4 mRNA的表達(dá)水平

人腦膠質(zhì)瘤組織中miR-671-3p mRNA表達(dá)量顯著高于癌旁正常組織，CKAP4 mRNA表達(dá)量顯著低于癌旁正常組織(P<0.05；圖1)。

圖1 人腦膠質(zhì)瘤組織中miR-671-3p、CKAP4 mRNA的表達(dá)水平a為P<0.05，與癌旁正常組織比較。

2.2 miR-671-3p對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響

自第4天起，與miR-671-3p NC組比較，miR-671-3p mimic組細(xì)胞增殖率升高，miR-671-3p inhibitor組增殖率降低；3組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；圖2)。

圖2 miR-671-3p對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響a為P<0.05，第4、5、6天3組間兩兩比較。

2.3 miR-671-3p對(duì)U251細(xì)胞遷移的影響

與miR-671-3p NC組比較，48 h后miR-671-3p mimic組細(xì)胞穿過(guò)小室膜細(xì)胞數(shù)顯著增加，而miR-671-3p inhibitor組穿過(guò)小室膜細(xì)胞數(shù)最少，3組細(xì)胞遷移率兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

圖3 miR-671-3p對(duì)U251細(xì)胞遷移率的影響(200×)1為miR-671-3p NC組；2為miR-671-3p mimic組；3為miR-671-3p inhibitor組。a為P<0.05，與miR-671-3p NC組比較；b為P<0.05，與miR-671-3p mimic組比較。

2.4 miR-671-3p對(duì)CKAP4具有靶向調(diào)節(jié)作用

為預(yù)測(cè)miR-671-3p的潛在靶點(diǎn)，本研究通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站(www.Targetscan.org)尋找miR-671-3p的潛在作用靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)miR-671-3p與CKAP4有潛在的結(jié)合位點(diǎn)(圖4A)。為了檢測(cè)CKAP4是否被miR-671-3p直接抑制，通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，在WT-CKAP4與miR-20a mimic共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶報(bào)告基因活性明顯下降(P<0.05；圖4B)，說(shuō)明miR-671-3p能夠直接抑制CKAP4表達(dá)。

圖4 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)CKAP4為miR-671-3p的靶基因A為生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-671-3p與CKAP4 3′-UTR結(jié)合位點(diǎn)；B為雙熒光素酶活性測(cè)定。a為P<0.05，與miR-671-3p NC組比較。

2.5 miR-671-3p對(duì)CKAP4的調(diào)控作用

與miR-671-3p NC組比較，miR-671-3p mimic組CKAP4蛋白表達(dá)顯著減弱；miR-671-3p inhibitor組CKAP4蛋白表達(dá)較miR-671-3p mimic組增強(qiáng)(P<0.05；圖5)。

圖5 miR-671-3p對(duì)CKAP4蛋白表達(dá)的調(diào)控作用1為miR-671-3p NC組；2為miR-671-3p mimic組；3為miR-671-3p inhibitor組。a為P<0.05，與miR-671-3p NC組比較；b為P<0.05，與miR-671-3p mimic組比較。

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤是由遺傳高危因素和環(huán)境致癌因素相互作用導(dǎo)致大腦膠質(zhì)細(xì)胞癌變所產(chǎn)生，作用機(jī)制較復(fù)雜且尚存在爭(zhēng)議[6]。現(xiàn)階段腦膠質(zhì)瘤以手術(shù)治療為主，輔以放化療，但因腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖迅速、惡性程度高，患者往往預(yù)后不良。有研究認(rèn)為腦膠質(zhì)瘤本質(zhì)上是一種多基因異常的疾病，由于原癌基因過(guò)表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞異常增殖[7]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展，小分子miRNA不僅能夠輕松從細(xì)胞中分泌出來(lái)，在治療上使用也非常方便[8]，因此本研究從分子基因角度探討腦膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制，以期為腦膠質(zhì)瘤的基因靶向治療提供新的方向。

miR-671可分為miR-671-3p和miR-671-5p，miR-671-5p具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。本研究結(jié)果顯示，miR-671-3p在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，miR-671-3p模擬物可顯著提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移能力，而通過(guò)miR-671-3p抑制劑處理后細(xì)胞增殖和遷移能力受到顯著抑制，提示高表達(dá)的miR-671-3p促進(jìn)了腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移能力。

CKAP4屬于跨膜蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族成員，可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及有絲分裂過(guò)程，是食管癌、肝細(xì)胞肝癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、胃癌腫瘤疾病發(fā)生、進(jìn)展的重要機(jī)制[9-10]。人CKAP4蛋白可特異性介導(dǎo)多種分泌性蛋白，影響Wnt通路以發(fā)揮拮抗抗癌作用。Zhao等[11]對(duì)CKAP4基因敲除鼠研究發(fā)現(xiàn)，CKAP4低表達(dá)可顯著抑制腹主動(dòng)脈瘤增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，CKAP4在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中低表達(dá)，說(shuō)明CKAP4具有抑制癌癥進(jìn)展的作用。miR-671-3p在腦膠質(zhì)瘤中作用機(jī)制的相關(guān)報(bào)道較少，為明確其潛在的作用靶點(diǎn)，本研究對(duì)miR-671-3p的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-671-3p與CKAP4 3′-UTR存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，確定CKAP4是miR-671-3p的潛在功能靶點(diǎn)。熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng) CKAP4 3′-UTR存在時(shí)，轉(zhuǎn)染miR-671-3p模擬物導(dǎo)致熒光素酶活性顯著降低；而當(dāng)報(bào)告質(zhì)粒在含有突變體CKAP4 3′-UTR的載體中時(shí)，熒光素酶活性無(wú)該變化。上述結(jié)果表明，CKAP4 3′-UTR特定區(qū)域內(nèi)的序列確實(shí)存在相互作用使miR-671-3p直接靶向CKAP4。為了進(jìn)一步研究miR-671-3p是否調(diào)節(jié)CKAP4的表達(dá)，本研究分析miR-671-3p表達(dá)對(duì)U252細(xì)胞CKAP4蛋白水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)的miR-671-3p可顯著降低CKAP4表達(dá)水平，而miR-671-3p抑制物可逆轉(zhuǎn)miR-671-3p過(guò)表達(dá)對(duì)CKAP4的抑制作用。本研究結(jié)果證實(shí)了miR-671-3p可靶向作用于CKAP4而促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，miR-671-3p對(duì)CKAP4的負(fù)調(diào)控可能與miR-671-3p在膠質(zhì)瘤進(jìn)展中的功能作用有關(guān)。目前研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB誘導(dǎo)miR-671-5P維持神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中TGF-β/Smad信號(hào)通路的活化[12]；miR-671-3p在IDH1 R132H突變的人腦膠質(zhì)瘤中通過(guò)下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)來(lái)促進(jìn)膠質(zhì)瘤其遷移和侵襲[13]；膠質(zhì)瘤細(xì)胞外泌體通過(guò)分泌miR-671-3p靶向激活多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[14]。本研究結(jié)合既往文獻(xiàn)分析可能機(jī)制為miR-671-3p高表達(dá)時(shí)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)受到抑制，進(jìn)而影響血管形成和腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖[15]。由此提示，miR-671-3p高表達(dá)可促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖及侵襲，且miR-671-3p可能是人腦膠質(zhì)瘤治療的重要潛在靶標(biāo)。

綜上所述，miR-671-3p在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)，CKAP4在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中低表達(dá)，二者呈負(fù)相關(guān)；miR-671-3p對(duì)細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，CKAP4為miR-671-3p的潛在功能靶點(diǎn)，miR-671-3p可靶向抑制CKAP4表達(dá)發(fā)揮促癌作用，miR-671-3p抑制劑可逆轉(zhuǎn)miR-671-3p對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，可能成為腦膠質(zhì)瘤疾病中治療的新靶點(diǎn)。但由于時(shí)間限制、樣本量小，僅以單一miRNA作為腦膠質(zhì)瘤進(jìn)展的預(yù)測(cè)因子，CKAP4蛋白可能也會(huì)受其他miRNA的影響，仍需設(shè)計(jì)更為嚴(yán)密、多中心、大樣本、雙盲的研究進(jìn)一步分析。