不同病情程度ICP孕婦血清GCA、ALT、AST、TBIL水平及胎盤HIF-1α蛋白表達(dá)情況觀察＊

曾觀銀 王彤 陳秀蘭 程楚云

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥（intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP）的發(fā)病率為8% ～12%，主要特征是皮膚瘙癢和膽汁酸水平升高，上述表現(xiàn)可在分娩后消失，但具有復(fù)發(fā)性，且可導(dǎo)致嚴(yán)重的圍產(chǎn)兒不良結(jié)局，如早產(chǎn)、胎兒發(fā)育遲緩，甚至死產(chǎn)等[1-3]。甘氨膽酸（GCA）、總膽汁酸（TBA）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）水平是臨床最常用于評(píng)價(jià)ICP患者病情嚴(yán)重程度的血清學(xué)指標(biāo)[4]。因ICP可引起胎盤的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)急性缺氧，而缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）為一種氧化應(yīng)激誘導(dǎo)因子，能在高膽汁酸代謝條件下促進(jìn)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡等一系列變化[5-6]。但臨床對(duì)于不同病情程度ICP患者的HIF-1α表達(dá)情況的臨床證據(jù)不足。故本研究納入東莞市第八人民醫(yī)院收治的ICP孕婦與健康孕婦做對(duì)比，探討不同病情程度孕婦的膽汁酸、肝酶水平及胎盤HIF-1α蛋白表達(dá)情況，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性選擇東莞市第八人民醫(yī)院2020年3-12月收治的62例ICP孕婦作為觀察組，并納入同期于本院產(chǎn)檢的62例健康孕婦作為對(duì)照組。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠中晚期孕婦，對(duì)照組TBA＜10 μmol/L，觀察組TBA≥10 μmol/L，符合文獻(xiàn)[7]中ICP的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②單胎頭位；③已排除其他原因?qū)е碌腡BA異常；④均于本院規(guī)律產(chǎn)檢。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①肝膽系統(tǒng)病史；②其他原因引起的皮膚瘙癢；③伴妊娠期糖尿病、高血壓、貧血等妊娠期合并癥；④合并心臟、腎等器官功能不全；⑤交流困難，無(wú)法配合檢測(cè)工作；⑥合并TORCH、梅毒等病毒感染。其中對(duì)照組，年齡24 ～32歲，平均（28.34±2.13）歲；孕周34 ～39周，平均（36.75±1.24）周；產(chǎn)次0 ～2次，平均（1.13±0.30）次。觀察組，年齡24 ～32歲，平 均（28.08±2.40） 歲； 孕 周 34 ～39周， 平 均（36.70±1.21）周；產(chǎn)次0 ～2次，平均（1.16±0.25）次；輕度（血清TBA為10 ～40 μmol/L）40例，重度（血清TBA＞40 μmol/L）22例。兩組年齡、孕周、產(chǎn)次對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

（1）肝功能指標(biāo)檢測(cè)：入組后，采集孕婦空腹靜脈全血3 ml，置于加入抗凝劑的一次性真空采管中，在采集血樣30 min內(nèi)，采用全自動(dòng)生化分析儀（日本東芝集團(tuán)；TBA120）測(cè)定所有研究對(duì)象血清中 GCA、ALT、AST、TBIL。（2）HIF-1α 蛋 白 檢測(cè)：①樣本收集與處理。在孕婦分娩30 min內(nèi)，無(wú)菌條件下取2.5 cm×2.5 cm的胎盤組織3塊，盡量避開組織鈣化區(qū)域及壞死區(qū)域。采用10%中性甲醛固定組織，石蠟包埋切片，經(jīng)脫蠟水化抗體修復(fù)后行免疫組織化學(xué)染色。②血清封閉后加入HIF-1α抗體（博士德生物工程有限公司），4 ℃過(guò)夜。PBS洗滌3次×5 min，滴加二抗（廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司），37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次×5 min后顯色液（廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司）顯色，封片，鏡下觀察。③結(jié)果觀察。切片至少觀察10個(gè)高倍鏡視野，觀察細(xì)胞漿和細(xì)胞核，陽(yáng)性著色呈黃色、棕黃色、褐色等。根據(jù)其著色程度評(píng)分，0分為無(wú)色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為褐色；根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞占比評(píng)分，占比≤10%為1分，占比11% ～50%為2分，占比51% ～75%為3分，占比＞75%為4分。HIF-1α表達(dá)計(jì)分=著色程度評(píng)分×陽(yáng)性細(xì)胞占比評(píng)分，總分12分，＜3分為陰性，用“-”表示；總分3 ～5分為弱陽(yáng)性，用“+”表示；總分6 ～9分為陽(yáng)性，用“++”表示；總分＞9分為強(qiáng)陽(yáng)性，用“+++”表示[8]。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

（1）比較兩組的GCA、ALT、AST及TBIL水平；（2）比較兩組分娩后胎盤HIF-1α蛋白表達(dá)情況，總陽(yáng)性率=（弱陽(yáng)性+陽(yáng)性+強(qiáng)陽(yáng)性）/總例數(shù)×100%；（3）對(duì)比不同病情程度ICP孕婦GCA、ALT、AST及TBIL水平；（4）對(duì)比不同病情程度ICP孕婦胎盤HIF-1α蛋白表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩組肝膽血清指標(biāo)對(duì)比

觀察組的GCA、ALT、AST、TBIL水平均高于對(duì)照組（P＜0.05），見表1。

表1 兩組肝膽血清指標(biāo)對(duì)比（±s）

表1 兩組肝膽血清指標(biāo)對(duì)比（±s）

組別 GCA（mg/L） ALT（U/L） AST（U/L） TBIL（μmol/L）對(duì)照組（n=62） 3.04±0.72 21.75±5.18 18.64±3.27 11.26±2.30觀察組（n=62） 22.36±7.29 45.47±10.23 44.36±8.11 34.68±6.59 t值 20.767 16.288 14.300 26.420 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2 兩組胎盤HIF-1α蛋白表達(dá)情況對(duì)比

觀察組的胎盤HIF-1α蛋白表達(dá)總陽(yáng)性率為72.58%，高于對(duì)照組的53.23%（P＜0.05），見表2。

表2 兩組HIF-1α蛋白表達(dá)情況對(duì)比[例（%）]

2.3 ICP不同病情程度孕婦的肝膽血清指標(biāo)對(duì)比

重度ICP孕婦的GCA、ALT、AST、TBIL水平均高于輕度（P＜0.05），見表3。

表3 ICP不同病情程度孕婦的肝膽血清指標(biāo)對(duì)比（±s）

表3 ICP不同病情程度孕婦的肝膽血清指標(biāo)對(duì)比（±s）

組別 GCA（mg/L） ALT（U/L） AST（U/L） TBIL（μmol/L）輕度（n=40） 19.52±4.61 34.37±4.21 40.39±4.16 30.61±7.83重度（n=22） 28.69±7.80 47.32±5.33 45.64±5.95 44.28±8.22 t值 5.050 12.239 3.674 6.371 P值 ＜0.001 ＜0.001 0.001 ＜0.001

2.4 ICP不同病情程度孕婦的胎盤HIF-1α蛋白表達(dá)情況對(duì)比

重度ICP孕婦的胎盤HIF-1α蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為94.45%，高于輕度ICP孕婦的60.00%（P＜0.05），見表4。

表4 ICP不同病情程度孕婦的HIF-1α蛋白表達(dá)情況對(duì)比[例（%）]

3 討論

ICP主要發(fā)生在妊娠中晚期，多通過(guò)TBA水平進(jìn)行病情程度的分級(jí)。因孕婦有一定程度的肝功能損傷，但可表現(xiàn)為伴有或不伴有肝酶水平升高。另因胎盤內(nèi)存在慢性缺氧變化，而HIF-1α蛋白是細(xì)胞在缺氧條件下產(chǎn)生的具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，HIF-1α蛋白的高表達(dá)可加劇白介素-6（IL-6）等炎癥因子的表達(dá)，加重胎盤的血管損傷、影響臍動(dòng)靜脈的血流灌注動(dòng)力學(xué)，可導(dǎo)致新生兒不良結(jié)局[9-10]?，F(xiàn)階段的研究對(duì)于HIF-1α蛋白在不同病情程度ICP孕婦中的表達(dá)情況研究不足。為進(jìn)一步揭示HIF-1α蛋白在ICP孕婦胎盤中的表達(dá)情況，本研究將納入ICP孕婦與健康孕婦進(jìn)行對(duì)比。

肝酶水平上升提示肝細(xì)胞膜的破壞，HIF-1α蛋白是缺氧再灌注損傷的啟動(dòng)因子[11]。本研究結(jié)果顯示：觀察組肝膽血清指標(biāo)水平均高于對(duì)照組，觀察組的胎盤HIF-1α蛋白表達(dá)總陽(yáng)性率高于對(duì)照組，重度ICP孕婦的肝膽血清指標(biāo)水平均高于輕度孕婦（P＜0.05），重度ICP孕婦的胎盤HIF-1α蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高于輕度（P＞0.05），說(shuō)明ICP孕婦的膽汁酸及肝酶水平、胎盤HIF-1α蛋白表達(dá)均較健康孕婦高，且其水平變化與病情嚴(yán)重程度相關(guān)。這一結(jié)論與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的研究相符，但該報(bào)道顯示輕度患者的HIF-1α蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為92.70%，低于重度患者的100%，較本研究高，產(chǎn)生這一差異可能因?yàn)槿藶榕袛嘟Y(jié)果會(huì)出現(xiàn)一定偏差，也可能與樣本量的差異有關(guān)。

正常氧分壓時(shí)，細(xì)胞中的HIF-1α亞基通過(guò)酶解系統(tǒng)迅速降解，在胞漿中幾乎檢測(cè)不到，其半衰期僅為5 min[13]。但由于雌激素、遺傳等因素導(dǎo)致的膽汁酸在妊娠中晚期的積聚和對(duì)絨毛的損害，造成胎盤功能下降，使得胎盤-胎兒系統(tǒng)的環(huán)境缺氧，導(dǎo)致胎盤-胎兒系統(tǒng)存在慢性缺氧病理變化，從而激活HIF-1α蛋白的表達(dá)[14]。同時(shí)由于細(xì)胞氧分壓降低，使得HIF-1α的降解過(guò)程受到抑制，在胎盤細(xì)胞中累積，加重對(duì)胎盤的損傷，以及HIF-1α蛋白的高表達(dá)可影響肝細(xì)胞對(duì)膽汁酸的正常分解過(guò)程，引起膽汁酸水平的持續(xù)上升，而高膽汁酸水平也可直接損傷胎兒器官及組織，并導(dǎo)致患者肝臟細(xì)胞膜的氧化性損傷[15]。另外膽汁酸對(duì)于肝臟細(xì)胞膜有促分解作用，繼而導(dǎo)致ALT、AST、TBA釋放增多，肝酶持續(xù)高水平分泌會(huì)導(dǎo)致臍血供氧量降低，故胎盤的缺氧程度與膽汁酸、肝酶、HIF-1α蛋白水平有密切關(guān)聯(lián)，且HIF-1α蛋白表達(dá)隨著膽汁酸及肝酶水平異常升高而增加。

綜上所述，ICP孕婦的膽汁酸、肝酶水平及胎盤HIF-1α蛋白表達(dá)較正常孕婦高，重度ICP孕婦的胎盤HIF-1α蛋白表達(dá)高于輕度孕婦。