不明原因復發(fā)性流產患者血漿中PAI-1水平表達及其基因啟動區(qū)4G/5G位點多態(tài)性分析＊

劉玉美 胡春青 唐曉勇 雷永革 李春容 藍紅

不明原因復發(fā)性流產（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）是指孕 20周前連續(xù)發(fā)生2次或2次以上不明原因的流產，是妊娠期最常見的并發(fā)癥之一[1]。URSA病因至今未明，隨著分子生物學深入研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病與血栓前狀態(tài)有密切關系[2-3]。血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）是一種絲氨酸蛋白酶抑制物和纖溶酶原激活物的主要抑制因子，對纖溶活性具有重要的調節(jié)作用，是防止血栓形成的重要保護因素。有研究表明，PAI-1水平及其基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）與URSA的發(fā)生發(fā)展及妊娠不良結局有密切關系，但不同地區(qū)存在很大差異[4-5]。為此，本研究對深圳市大鵬新區(qū)婦幼保健院URSA患者、健康育齡婦女PAI-1水平及其基因4G/5G位點SNP進行了調查分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年5月-2021年3月本院婦產科門診及住院部就診的URSA患者75例為URSA組，選擇同期在本院婦產科門診及住院部生育史正常的健康育齡婦女120例為對照組。診斷標準：URSA診斷參照有關文獻[6]。納入標準：URSA組患者符合上述診斷標準，均為原因不明流產，連續(xù)流產次數(shù)≥3次；對照組患者均既往無不良孕產史、無自然流產史，無死胎或胎兒宮內發(fā)育遲緩病史和無血栓性疾病史，且至少有一次正常妊娠史；近兩個月未使用抗凝或促纖溶藥物；未服用避孕藥物。排除標準：伴有內科及內分泌系統(tǒng)疾病；懷孕期間有大量飲含酒精類飲品、含咖啡因類食品及劇烈運動等嚴重不良嗜好和生活習慣；男方精液常規(guī)及夫妻雙方染色體異常；TORCH及生殖抗體檢測等異常；凝血功能障礙；近期有使用補腎活血類中藥或激素類藥物。URSA組：年齡19 ～32歲，平均（26.13±5.92）歲。對照組：在孕和非孕，各60例；年齡20 ～31歲，平均（26.75±5.64）歲。兩組年齡比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。患者均知情同意并簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意批準。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 AE275全自動酶標分析儀由深圳愛康生物有限公司提供；PAI-1試劑購于上海太陽生物技術有限公司；DNA提取試劑盒購于深圳亞能科技有限公司；ABI7500型實時定量突光聚合酶鏈式反應儀由美國ABI公司提供；基因SNP多態(tài)性分析試劑盒由華大基因科技公司提供。

1.2.2 標本采集 清晨空腹抽取所兩組外周靜脈血5 ml，其中3 ml加入到一次性無抗凝劑的干燥管內于室溫靜置 30 min 后，離心 5 min（3 500 r/min），用作PAI-1水平測定；其余的靜脈血加入到乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝管內，混勻，用于PAI-1基因單核苷酸多態(tài)性分析。

1.2.3 PAI-1水平檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血漿中PAI-1水平，操作均嚴格按試劑和儀器說明書進行，檢測前對儀器進行保養(yǎng)、校正，檢測時同時設計空白孔、陰陽孔及質控孔，待上述所有檢測孔的OD值均在參考有效范圍內才進行標本結果判讀，否則重新進行檢測。

1.2.4 PAI-1基因單核苷酸多態(tài)性分析 采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）法分析PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G位點多態(tài)性，具體操作，（1）基因DNA提取：使用DNA提取試劑盒抽提全血基因組DNA。（2）引物設計：①4G上游引物，5’-GTCTGGACACGTGGGGA-3’； ② 5G 上 游 引 物，5’-GTCTGGACACGTGGGGG-3’；③陽性對照上游引物，5’-AGCTTTTACCATGGTAACCC-CTGGT-3’； ④ 共同下游引物，5’-CAGGTCACTGTGGAGTTATC-3’。（3）PCR反應體系：反應總體積為20.0 μl，其中 含 DNA 模板 3.0 μl，10×PCR 緩沖液 2.0 μl，25 mmol/L 的 MgCl22.0 μl，10 mmol/L 的 dNTP 1.0 μl，Taq DNA 聚 合酶 2.0 U，5.0 μmol/L 的 4G或5G引物1.0 μl，5.0 μmol/L的上、下游引物各0.4 μl。（4）PCR 擴增：95 ℃預變性 5 min，然后以 95 ℃變性 1 min → 58 ℃復性 1 min → 72 ℃延伸 1 min，反復循環(huán) 30 次，最后 72 ℃延伸 5 min。（5）電泳：取PCR擴增產物于30 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳40 min，并對電泳結果采用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析其基因型。PAI-1基因SNP分析由華大基因科技有限公司進行檢測分析。

1.3 觀察指標

兩組均進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，比較兩組PAI-1水平，PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G SNP，不同基因型URSA患者PAI-1水平。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 兩組PAI-1水平比較

URSA組 PAI-1水 平 為（9.76±2.85）ng/ml，明顯高于對照組的（5.23±1.09）ng/ml，差異有統(tǒng)計學意義（t=6.057 4，P＜0.05）。

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗

URSA組和對照組PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G位點SNP均檢出5G/5G、5G/4G和4G/4G 3種基因型，經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗，結果顯示兩組均符合 Hardy-Weinberg 遺傳平衡（ χ2=0.033 8、0.014 5，P＞0.05），說明抽樣具有樣本代表性。

2.3 兩組PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G SNP比較

URSA組PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G位點的4G/4G基因型和4G等位基因檢出率分別為41.33%和64.67%，均明顯高于對照組的12.50%和35.00%（P＜0.05），且4G/4G基因型和4G等位基因患URSA的相對風險增加（OR=3.726 5，95%CI：1.603 4，5.925 3和 OR=2.382 5，95%CI：1.302 7，3.480 1），見表 1。

表1 兩組PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G SNP比較

2.4 不同基因型URSA患者PAI-1水平比較

攜帶4G/4G基因型URSA患者PAI-1水平為（12.03±3.17）ng/ml，明顯高于5G/4G 基因型的（8.52±2.40）ng/ml（t=3.718 2，P＜0.05）， 而 5G/4G 基因型又明顯高于5G/5G基因型的（6.78±1.34）ng/ml（t=2.902 1，P＜0.05），不同基因型患者 PAI-1水平比較差異有統(tǒng)計學意義（F=12.341 8，P＜0.05）。

3 討論

URSA是臨床上婦科較為常見的一種妊娠相關性疾病，發(fā)生率為0.5% ～2.5%，且呈逐年上升趨勢，嚴重影響育齡婦女的順利生育，對生育年齡夫妻造成巨大的社會及心理壓力，這不僅損害育齡婦女的身心健康，還會引起一系列的家庭與社會問題[7]。但URSA發(fā)病病因不明，給臨床診療及預防帶來很大困難。因此，探索URSA病因、發(fā)病機制及相關影響因素，對其診斷、治療及預防至關重要。

血液中促凝因子水平增高、抗凝物質水平降低及纖維蛋白溶解減少等原因均可引起妊娠期婦女血液呈高凝狀態(tài)，導致胎盤微血管血栓形成，影響胎盤和胎兒血供，導致胚胎供血不足，甚至絨毛壞死，從而導致流產。同時凝血和纖溶系統(tǒng)功能紊亂也可引起胎盤組織內大量血栓形成和纖維蛋白沉積，進而導致流產[8-9]。而PAI-1水平升高是引起血液呈高凝狀態(tài)的重要原因之一，也是引起動靜脈栓塞的獨立危險因素。有研究表明，URSA患者血漿中PAI-1水平明顯升高，但具有地域性差異[10-11]。本研究結果顯示，URSA組患者PAI-1水平比對照組高（P＜0.05），略高于陳嬋[12]報道海南地區(qū)的（9.36±2.25）ng/ml，但明顯低于馬玉祥[13]報道陜西地區(qū)的（37.58±3.27）ng/ml，這表明PAI-1水平升高可能與URSA發(fā)病有密切關系，這可能與PAI-1水平升高加強其對纖溶酶原激活物抑制作用，導致胎盤微血栓生成時纖維蛋白沉積，胎盤床發(fā)生梗死，引起胎兒缺血、缺氧，從而引發(fā)URSA等有關。

PAI-1是組織重構過程中控制蛋白質水解的關鍵酶，位于7號染色體長臂，由8個內含子和9個外顯子組成，其基因啟動子區(qū)多個位點易發(fā)生突變，進而導致PAI與纖溶酶原激活物（PA）之間失去平衡，PAI-1可通過與PA結合形成穩(wěn)定無活性的復合物導致胎盤組織廣泛血栓形成[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，PAI-1基因啟動子區(qū)插入或缺失一個堿基，可影響其水平和活性，與URSA的發(fā)生發(fā)展及妊娠不良結局有密切關系，且存在地域性和種族性差異[15]。本研究結果顯示，URSA組PAI-1基因啟動區(qū)4G/5G位點的4G/4G基因型和4G等位基因頻率均明顯高于對照組（P＜0.05），且攜帶4G/4G基因型和4G等位基因患URSA的相對風險增加，這表明了PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G位點存在多態(tài)性，且可能在URSA發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用，其中4G/4G基因型可能是深圳大鵬新區(qū)URSA發(fā)病的危險易感基因。此外，結果還顯示，不同PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G位點基因型URSA患者PAI-1水平比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中攜帶4G/4G基因型患者PAI-1水平最高，與有關報道基本一致[16]。這可能與PAI-1基因啟動區(qū)域4G等位基因的純合型可能影響PAI-1基因轉錄，從而增加其水平表達有關。

綜上所述，URSA患者PAI-1水平明顯升高及其基因啟動子區(qū)4G/5G位點呈多態(tài)性，其中4G/4G基因型和4G等位基因患URSA的相對風險增加，且不同基因型URSA患者PAI-1水平存在很大差異，其中4G/4G基因型可能是深圳大鵬新區(qū)URSA發(fā)病的易感基因。