奧拉西坦聯合rTMS減輕腦缺血再灌注損傷大鼠缺血側腦皮質神經元氧化應激損傷

劉澤晶， 徐 豐， 劉 勇， 呂 英， 錢曉蕊， 楊富佼， 趙琳琳， 劉 曦

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江省哈爾濱市150006；2.黑龍江中醫藥大學附屬第四醫院，黑龍江省哈爾濱市150001；3.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江省哈爾濱市150040)

腦缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，I/RI)是指缺血腦組織在恢復血流灌注后損傷反而加重的現象，多發于缺血性腦卒中、腦外傷、心肺復蘇等腦缺血后的再灌注過程中。既往研究認為，I/RI過程中產生的大量氧自由基是導致腦皮質神經元損傷的重要機制之一[1]，抗氧化劑治療可以清除腦組織過多的氧自由基，減輕腦組織氧化應激損傷。奧拉西坦(oxiracetam，Oxi)是一種新型y-氨基丁酸環化衍生物，不僅能有效促進腦氧代謝過程，還能激活、保護及修復神經元細胞，發揮腦保護作用[2]。已有研究顯示，Oxi中的有效成分(S)-Oxi可以調節腦缺血大鼠腦皮質區的能量代謝，發揮抗氧化作用，減輕腦組織損傷[3]。重復經顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS)是一種通過在大腦中產生感應聚焦電流，實現瞬間調制大腦皮層的無創刺激方式，在腦部疾病的診治中發揮著至關重要的作用[4]。既往研究顯示，接受rTMS刺激治療腦梗死患者的神經功能缺損情況明顯優于接受常規手段治療的患者[5]。但Oxi與rTMS聯合是否能發揮協同增效作用，且這一作用是否與氧化應激過程相關尚不明確。因此，本研究探索了Oxi聯合rTMS對腦I/RI大鼠缺血側腦皮質神經元的保護作用，并進一步分析其對氧化應激過程的調節作用，旨在為臨床治療提供一定的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 動物、試劑和儀器

SPF級SD雄性大鼠60只，體質量220～250 g，6～8周齡，由哈爾濱醫科大學實驗動物學部提供，動物許可證號SCXK(黑)2019-001。實驗開始前大鼠于實驗室環境中適應性喂養1周，溫度(25±2)℃，相對濕度(40±5)%，光照周期10～12 h，整個實驗過程中大鼠自由飲水和進食。

Oxi(福安藥業集團重慶博圣制藥公司，國藥準字H20143232)；氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride，TTC)(德國Biofroxx公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；B細胞淋巴瘤2(B cell lymphoma 2，Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、活化的Caspase-3(Cleaved Caspase-3)、核因子E2相關因子2(nuclear factor E2 associated factor 2，Nrf2)、血紅素加氧酶(hemeoxygenase-1，HO-1)、醌氧化還原酶1(quinone oxidoreductase 1，NQO-1)單克隆抗體(英國Abcam公司)；辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)標記羊抗兔IgG(艾美捷科技有限公司)。Rapid2型經顱磁刺激儀(英國Magstim公司)。

1.2 腦缺血再灌注損傷模型的建立和分組

60只SD大鼠適應性喂養7天后，隨機均分為對照組、I/RI組、Oxi組、rTMS組和Oxi+rTMS組。除對照組外所有大鼠均采用Longa法[6]制備大鼠腦I/RI模型，腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液(2 μL/g)，于左側頸總動脈離分叉處約5 mm處剪一小口，于近心端采用栓線結扎腦中動脈，并縫合，缺血2 h后拔出栓線實現再灌注。對照組大鼠僅暴露腦中動脈，插入栓線，不進行結扎，其余步驟同手術組。若再灌注后24 h內，造模大鼠出現神經缺損癥狀，如左前爪伸展不完全，行走時身體有向左側轉圈或傾倒的傾向等，則為造模成功[7]。造模成功后，Oxi組以200 μg/g Oxi腹腔注射，1次/天；rTMS組以rTMS刺激，在大鼠清醒的狀態下固定頭部，將圓形線圈中線對準人字縫，使線圈中心處于前囟與人字縫中間，磁刺激頻率10 Hz，100次/串，5串/天，每串間隔時間30 s，刺激強度0.5 T；Oxi+rTMS組以Oxi干預聯合rTMS；對照組、I/RI組以等量生理鹽水腹腔注射，以上5組均連續干預14天。

1.3 大鼠神經功能和腦梗死體積的檢測

末次干預后，采用Zea Longa 5分制標準[8]進行神經體征缺失評分(neurological defectscore, NDS)。檢測后，斷頸處死各組大鼠，取大鼠左側腦皮質組織，-20 ℃冰箱中冷凍20 min后，腦組織冠狀切片后置于2%氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride，TTC)溶液，37 ℃ 15 min。隨后取出切片，生理鹽水沖洗2次后置于4%多聚甲醛中進行組織固定，24 h后采用圖像處理軟件Image J測量各組腦梗死灶面積，并計算腦梗死體積百分比(infarct volume rate，IVR)。

1.4 腦組織損傷和神經元細胞凋亡率的檢測

取大鼠左側腦皮質組織，4%多聚甲醛固定， 4 μm組織切片，行常規HE染色或者TUNEL染色，光學顯微鏡下觀察組織形態，采用Image J對TUNEL染色圖像進行分析處理，每張圖片隨機選取5個視野，觀察每個視野凋亡細胞數(細胞核呈棕褐色或棕黃色顆粒的細胞)和總細胞數，細胞凋亡率(%)=(凋亡細胞數/總細胞數)×100%。

1.5 腦組織中氧化應激相關因子的檢測

取大鼠左側腦皮質組織，制備組織勻漿，嚴格按照試劑盒說明書，黃嘌呤氧化酶法檢測腦組織中SOD水平，化學比色法檢測腦組織GSH-Px水平，硫代巴比妥檢測腦組織MDA水平。

1.6 Western blotting檢測腦組織Nrf2、HO-1、NQO-1和凋亡相關蛋白表達

取大鼠左側腦皮質組織，勻漿，提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白水平，依次進行電泳、轉膜，滴加5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h，滴加一抗Nrf2(1∶500)、HO-1(1∶1 000)、NQO-1(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Caspase-3(1∶1 000)和Cleaved Caspase-3(1∶1 000)，4 ℃搖床中孵育24 h后洗膜，滴加二抗(1∶5 000)，滴加ECL顯影劑顯影，采用Image J軟件進行灰度分析，以β-actin為內參，計算各蛋白相對表達量。

1.7 統計學分析

2 結 果

2.1 Oxi聯合rTMS改善I/RI大鼠神經功能缺損和腦組織損傷

Oxi組、rTMS組和Oxi+rTMS組大鼠NDS評分和IVR明顯低于I/RI組，Oxi+rTMS組IVR進一步低于Oxi組和rTMS組(P<0.05；表1)。HE染色結果顯示，對照組腦組織未見明顯病理變化；I/RI組左側腦皮質神經元結構較疏松，間隙變寬，細胞核固縮深染，出現變性和壞死細胞；Oxi組、rTMS組和Oxi+rTMS組左側腦皮質神經元水腫程度減輕，變性和壞死細胞數量減少(圖1)。

表1 Oxi聯合rTMS改善I/RI大鼠神經功能和腦組織損傷

圖1 Oxi聯合rTMS減輕I/RI大鼠腦組織損傷(HE， 400×)

2.2 Oxi聯合rTMS抑制腦皮質神經元細胞凋亡

I/RI組大鼠腦皮質神經元細胞凋亡率、Bax/Bcl-2和Cleaved Caspase-3/Caspase-3蛋白表達明顯高于對照組(P<0.05)；而Oxi組、rTMS組和Oxi+rTMS組上述指標明顯低于I/RI組(P<0.05)；與Oxi組和rTMS組比較，Oxi+rTMS組上述改變更為顯著(P<0.05；圖2)。

圖2 Oxi聯合rTMS抑制I/RI大鼠腦皮質神經元細胞凋亡

2.3 Oxi聯合rTMS降低I/RI大鼠腦組織氧化應激水平

I/RI組大鼠腦組織SOD和GSH-Px明顯低于對照組，MDA明顯高于對照組(P<0.05)。Oxi組、rTMS組和Oxi+rTMS組腦組織SOD和GSH-Px明顯高于I/RI組，MDA明顯低于I/RI組(P<0.05)；與Oxi組和rTMS組比較，Oxi+rTMS組上述改變更為顯著(P<0.05；表2)。

表2 Oxi聯合rTMS降低I/RI大鼠腦組織氧化應激水平

2.4 Oxi聯合rTMS促進I/RI大鼠腦組織Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達

I/RI組大鼠腦組織Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白表達明顯高于對照組(P<0.05)。Oxi組、rTMS組和Oxi+rTMS組腦組織Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白表達明顯高于I/RI組(P<0.05)；與Oxi組和rTMS組比較，Oxi+rTMS組上述改變更為顯著(P<0.05；圖3)。

圖3 Oxi聯合rTMS促進I/RI大鼠腦組織Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達(Western blotting)

3 討 論

腦缺血再灌注(I/R)過程中誘導產生了大量氧自由基，引起細胞膜脂質過氧化，破壞線粒體結構，影響腦組織能量代謝障礙，還可以激活凋亡相關的信號通路，誘導神經細胞凋亡，加重腦組織損傷[9]。Oxi是一種神經營養藥物，可以提高癡呆大鼠腦組織抗氧化酶活性，減輕腦組織氧化應激損傷，發揮腦保護作用，目前已應用于臨床腦血管疾病的治療[10]。rTMS利用電磁感應的原理，可以重復使用脈沖磁場刺激大腦皮質神經元，影響神經元活動，調節腦組織能量代謝，改善神經功能[11]。本研究觀察了Oxi聯合rTMS干預對腦I/RI大鼠腦組織損傷的影響，發現Oxi和rTMS可以顯著改善I/RI大鼠的神經功能，減輕腦皮質組織損傷，縮小其腦梗死面積，且Oxi聯合rTMS干預可以明顯提高臨床作用效果，提示臨床可聯合應用Oxi聯合rTMS減輕腦缺血患者I/RI損傷，改善神經功能。

本研究中，Oxi和rTMS均可以抑制腦I/RI大鼠腦皮質神經元細胞凋亡，抑制Bax/Bcl-2和Cleaved Caspase-3/Caspase-3蛋白表達，且Oxi聯合rTMS干預可以明顯提高臨床作用效果。細胞凋亡信號通路主要包括由線粒體介導的內部細胞凋亡信號通路和死亡受體介導的外部細胞凋亡信號通路[12]。Bax/Bcl-2是一組調控線粒體凋亡途徑的蛋白，已有研究發現，I/RI過程中大量氧自由基可以誘導Bax轉位至膜上與Bcl-2結合，破壞線粒體膜的完整性，導致線粒體細胞色素C釋放進入胞漿，激活Caspase級聯反應，活化凋亡執行蛋白Caspase-3，誘導腦組織細胞凋亡[13]。Hong等[14]研究顯示，rTMS刺激可以抑制腦I/RI大鼠神經元細胞凋亡，縮小腦梗死體積，改善神經功能，提示Oxi聯合rTMS可能通過抑制腦皮質神經元細胞凋亡，減輕腦組織損傷，改善神經功能。

本研究中，Oxi和rTMS均可以促進腦I/RI大鼠腦組織Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白表達，且Oxi聯合rTMS干預可以明顯提高臨床作用效果。Nrf2是機體內最重要的抗氧化應激調節因子，可以調控多個抗氧化基因HO-1、NQO-1等表達，清除機體過多的氧自由基[15]。既往研究顯示，當細胞受到氧自由基刺激時，Nrf2可與其特異性受體Keap1發生解偶聯，轉位至細胞核，啟動抗氧化反應元件所調控的HO-1、NQO-1等基因表達[16]。趙宗剛等[17]研究顯示，Oxi可以促進腦梗死大鼠腦組織Nrf2表達，提高腦組織抗氧化能力，減輕腦組織氧化應激損傷，改善神經功能，提示Oxi聯合rTMS可以協同調節腦I/RI大鼠的氧化應激水平，減輕腦組織損傷。本研究中，Oxi和rTMS均可以升高腦I/RI大鼠腦組織SOD和GSH-Px活性，降低MDA水平，且Oxi聯合rTMS干預可以明顯提高臨床作用效果。SOD和GSH-Px均為細胞內重要的抗氧化酶，MDA可以反應細胞內氧自由濃度，提示Oxi聯合rTMS可以提高腦I/RI大鼠的抗氧化能力。關園等[18]研究顯示，Oxi可以提高心肌I/RI大鼠的心肌組織抗氧化能力，清除過多氧自由基，抑制心肌組織細胞凋亡，減輕心肌組織損傷。王金華等[19]研究顯示，rTMS可以提高血管性癡呆大鼠的腦組織抗氧化酶活性，抑制腦組織細胞凋亡，發揮神經保護作用，提示Oxi聯合rTMS可能通過調節Nrf2表達，降低I/RI過程中的氧化應激反應，減輕腦I/RI大鼠的氧化應激損傷。

綜上所述，Oxi聯合rTMS可以促進腦I/RI大鼠腦組織Nrf2蛋白表達，提高抗氧化酶活性，抑制缺血側腦皮質神經元細胞凋亡，減輕腦組織氧化應激損傷，改善神經功能，臨床可采用Oxi聯合rTMS治療減輕腦I/RI損傷。本研究不足之處在于僅在動物水平上探索了Oxi聯合rTMS對大鼠腦I/RI氧化應激損傷的影響，尚需大量的臨床試驗來驗證。