野黃芩素經(jīng)Akt/FoxO1信號通路抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡

林惠軍， 楊倩， 龔瀟

(四川大學(xué)華西醫(yī)院龍泉醫(yī)院眼科，四川省成都市 610100)

青光眼是致盲的主要原因之一，主要表現(xiàn)為視神經(jīng)損傷。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell，RGC)變性和視野喪失是視神經(jīng)損傷的主要特征，延緩RGC細(xì)胞凋亡和提高RGC存活是青光眼治療的一種潛在有效治療策略[1-2]。RGC-5是一種被廣泛應(yīng)用于青光眼細(xì)胞和分子機(jī)制研究的體外系統(tǒng)[3]。野黃芩素是從常用中藥黃芩中分離得到的一種天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化和抑制腫瘤血管生成等多種生物學(xué)功能[4]。野黃芩素能減輕缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的RGC損傷，但其具體機(jī)制尚不清楚[5]。叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O(forkhead box O，F(xiàn)oxO)是磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/Akt通路的下游靶點(diǎn)，通過磷酸化作用轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，降低其轉(zhuǎn)錄活性[6]，F(xiàn)oxO1在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞存活調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[7]。而FoxO1蛋白在分離的視網(wǎng)膜中有表達(dá)[8]，因此推測Akt介導(dǎo)的FoxO1信號通路可能在RGC凋亡中起作用。本研究檢測野黃芩素對RGC-5細(xì)胞凋亡的影響，并分析Akt/FoxO1信號通路在整個過程中的作用，為野黃芩素治療青光眼提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

野黃芩素和拉坦前列素(美國Sigma公司)；RGC-5細(xì)胞(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫)；30%H2O2和Hoechst 33258染色液(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；DMEM低糖培養(yǎng)基和胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(cell count kit 8，CCK-8)(美國Amresco公司)；活性氧(reactive oxygen species,ROS)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)(南京建成生物工程研究所)；RIPA裂解液(北京索萊寶生物技術(shù)公司)；Akt、磷酸化-Akt(phosphorylated Akt，p-Akt)、FoxO1、磷酸化-FoxO1(phosphorylated FoxO1，p-FoxO1)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、Caspase-3、GADPH和HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗(美國Santa Cruz公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；Sunrise型全自動酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；BD垂直電泳儀(美國BD公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下用含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)RGC-5細(xì)胞至融合70%左右。實驗分為陰性對照組、模型組、低野黃芩素組、高野黃芩素組和陽性對照組。陰性對照組不處理，其他組加入終濃度200 μmol/L H2O2構(gòu)建RGC氧化應(yīng)激損傷模型[9]；同時，低野黃芩素組和高野黃芩素組分別給與終濃度25和100 μmol/L野黃芩素[10]，陽性對照組給與終濃度25 μmol/L拉坦前列素[11]。將RGC-5細(xì)胞接種于不同孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后按每組因素干預(yù)24 h后進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.3 細(xì)胞增殖率的檢測

將細(xì)胞接種于96孔板(5×103個/孔)培養(yǎng)后，加入CCK-8(10 μL/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀測定光密度(OD)，細(xì)胞增殖率(%)=(實驗組OD-空白孔OD)/(陰性對照組OD-空白孔OD)×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡率的檢測

將細(xì)胞接種于6孔板(1×106個/孔)培養(yǎng)后，加入2 mL磷酸鹽緩沖液洗滌1次，4%多聚甲醛固定10 min，加入Hoechst 33258染色液，染色10 min后于熒光顯微鏡下計數(shù)凋亡陽性細(xì)胞。凋亡細(xì)胞的核呈明亮的凝結(jié)和碎裂，而非凋亡的細(xì)胞核染色質(zhì)呈淺藍(lán)色，結(jié)構(gòu)有序。細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，5個不同視野范圍內(nèi)計數(shù)超過500個細(xì)胞。

1.5 ROS和SOD的檢測

將細(xì)胞接種于6孔板(1×106個/孔)培養(yǎng)后，加入2 mL磷酸鹽緩沖液洗滌，細(xì)胞超聲破碎儀處理30 s，離心取上清，按試劑盒說明書檢測細(xì)胞ROS和SOD水平。

1.6 凋亡相關(guān)蛋白水平的檢測

將細(xì)胞接種于6孔板(1×106個/孔)培養(yǎng)后，加入2 mL磷酸鹽緩沖液洗滌，離心棄上清，加入RIPA裂解液(100 μL)裂解2 h，離心取上清，加入1/5體積5×Buffer，在沸水中變性，進(jìn)行電泳(20 μg/孔)，切膠后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，然后用5%脫脂牛奶在室溫下封膜1 h，將膜與Akt(1∶200)、p-Akt(1∶400)、FoxO1(1∶400)、p-FoxO1(1∶500)、Bcl-2(1∶300)、Bax(1∶400)和Caspase-3(1∶200)進(jìn)行孵育(4 ℃過夜)，磷酸鹽緩沖液洗滌1次，將膜與HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)在室溫下孵育30 min，顯色，采集圖像進(jìn)行分析(以GADPH為內(nèi)對照)。

1.7 統(tǒng)計分析

2 結(jié) 果2.1 野黃芩素對RGC-5細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與陰性對照組比較，其他組細(xì)胞增殖率降低，細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05)；與模型組比較，野黃芩素組和陽性對照組細(xì)胞增殖率增加，細(xì)胞凋亡率降低；且隨野黃芩素劑量增加差異更為顯著，但陽性對照組作用最明顯(P<0.05；圖1和表1)。

圖1 野黃芩素對RGC-5細(xì)胞凋亡的影響(箭頭所示為凋亡細(xì)胞，400×)

表1 野黃芩素對RGC-5細(xì)胞增殖和凋亡的影響(n=3) 單位：%

2.2 野黃芩素對ROS和SOD水平的影響

與陰性對照組比較，其他組細(xì)胞ROS水平增加，SOD水平降低(P<0.05)；與模型組比較，野黃芩素組和陽性對照組細(xì)胞ROS降低，SOD水平增加；且隨野黃芩素劑量增加差異更為顯著，但陽性對照組作用最明顯(P<0.05；表2)。

表2 野黃芩素對RGC-5細(xì)胞ROS和SOD水平的影響(n=3)

2.3 野黃芩素對凋亡相關(guān)蛋白水平的影響

與陰性對照組比較，其他組細(xì)胞p-Akt/Akt、p-FoxO1/FoxO1、Bcl-2水平降低，Bax和Caspase-3水平增加(P<0.05)；與模型組比較，野黃芩素組和陽性對照組細(xì)胞p-Akt/Akt、p-FoxO1/FoxO1、Bcl-2水平增加，Bax和Caspase-3水平降低；且隨野黃芩素劑量增加差異更為顯著，但陽性對照組作用最明顯(P<0.05；圖2和表3)。

圖2 野黃芩素對RGC-5細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白水平的影響

表3 野黃芩素對RGC-5細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白水平的影響(n=3)

3 討 論

RGC-5細(xì)胞在包括糖尿病視網(wǎng)膜病變或?qū)嶒炐郧喙庋墼趦?nèi)的任何疾病條件下都很容易受損，導(dǎo)致不可逆性視網(wǎng)膜損傷。一些研究表明，實驗性青光眼引起神經(jīng)元并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵事件是氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激時ROS產(chǎn)生增加，同時過度消耗抗氧化劑(如SOD)，使視網(wǎng)膜受損[12]。棕櫚酸誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性也是通過RGC-5細(xì)胞ROS和丙二醛產(chǎn)生增加而引起的，這也證實了上述推測[13]。有研究顯示，抗氧化劑野黃芩素在體外對H2O2誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞具有細(xì)胞保護(hù)作用，同時，野黃芩素對缺血損傷的RGC細(xì)胞和無長突細(xì)胞的保護(hù)作用也似乎至少與其抗氧化作用有關(guān)[14]。本研究結(jié)果顯示，野黃芩素能降低RGC-5細(xì)胞ROS水平，增加SOD水平，發(fā)揮抗氧化作用，與上述研究結(jié)果相一致。

眾所周知，線粒體參與許多代謝反應(yīng)，通過氧化磷酸化為細(xì)胞提供能量，然而，線粒體損傷在ROS產(chǎn)生后立即開始，使線粒體內(nèi)膜上的線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔過度開放，細(xì)胞凋亡信號因子從線粒體中流出，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示，野黃芩素能促進(jìn)RGC-5細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，雖然其作用強(qiáng)度不如青光眼治療的推薦藥物(拉坦前列素)，但作為一種新藥的研發(fā)，還是有進(jìn)一步研究的價值。

Akt/FoxO1信號通路是細(xì)胞對氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞級聯(lián)。越來越多的證據(jù)表明，Akt/FoxO1信號通路由ROS驅(qū)動[16]。Akt是PI3K/Akt通路下游信號通路中最重要的蛋白之一，是重要的抗凋亡調(diào)控因子。FoxO1也被認(rèn)為是PI3K/Akt信號通路的關(guān)鍵直接效應(yīng)因子，其核轉(zhuǎn)移會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[17]。進(jìn)一步的研究表明，F(xiàn)oxO1低表達(dá)賦予眼睛疾病相對較高的風(fēng)險，并證實了其在RGC細(xì)胞中的表達(dá)[18]。乙酰化、磷酸化和泛素化通過改變FoxO1的亞細(xì)胞定位來調(diào)節(jié)其活性。同時，PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002處理后的小鼠胚胎干細(xì)胞增殖明顯受到抑制，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性和時間依賴性[19]。葉酸缺乏也呈時間依賴性地降低Akt磷酸化水平來抑制FoxO1的轉(zhuǎn)錄激活，從而誘導(dǎo)小鼠卵母細(xì)胞凋亡[20]。在本研究中，野黃芩素促進(jìn)了RGC-5細(xì)胞Akt和FoxO1磷酸化，并呈劑量依賴性，表明激活A(yù)kt/FoxO1信號通路可以抑制RGC-5細(xì)胞凋亡。

FoxO1蛋白主要作為轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核中發(fā)揮作用，并作為單體與其相關(guān)的DNA靶向序列結(jié)合調(diào)控下游靶點(diǎn)，如Bcl-2、Fas配體、p27、磷酸酶與張力蛋白同源物和細(xì)胞周期蛋白等抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯[21]。Bcl-2是重要的抗凋亡分子，可通過與促凋亡蛋白(如Bax)相互作用來調(diào)控細(xì)胞凋亡。Bcl-2啟動子中存在兩個保守的FoxO1結(jié)合位點(diǎn)，Bcl-2啟動子的激活需要這兩個位點(diǎn)[22]。FoxO1在交感神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞中直接激活Bcl-2基因表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡[23]。Bcl-2的激活最終能抑制Caspase-3活化及早發(fā)揮出抗凋亡作用。在本研究中，野黃芩素促進(jìn)了RGC-5細(xì)胞Bcl-2水平增加，降低Bax和Caspase-3水平，共同調(diào)控H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞凋亡。

綜上所述，野黃芩素可抑制RGC-5細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，激活A(yù)kt/FoxO1信號通路，抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)RGC-5細(xì)胞增殖，這一發(fā)現(xiàn)為野黃芩素治療RGC凋亡相關(guān)眼病提供了新策略。