利多卡因?qū)σ认侔┘?xì)胞PANC-1增殖、凋亡和STING/IRF3/IFN-β通路的影響

劉炯， 汪向飛， 江斌

(十堰市太和醫(yī)院肝膽胰外科診療中心，湖北省十堰市 444200)

胰腺癌是全球第四大癌癥相關(guān)死亡原因，其5年總生存率低于7%，在所有癌癥中最低[1]，探索胰腺癌的新治療策略具有重要意義。某些麻醉藥不僅可用于手術(shù)鎮(zhèn)痛，還具有一定抗癌作用[2-3]。局部麻醉劑利多卡因具有抗炎、抗腫瘤等特殊功效，但其抗腫瘤機(jī)制尚不清楚[4]。干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon genes，STING)是一種跨膜蛋白，由環(huán)鳥苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase，cGAS)產(chǎn)生的環(huán)二核苷酸激活。STING通過促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的招募和激活來調(diào)節(jié)實體腫瘤的免疫抑制腫瘤微環(huán)境。STING激活導(dǎo)致了TANK結(jié)合激酶1(TANK-binding kinase 1，TBK1)的激活，磷酸化干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)誘導(dǎo)干擾素-β(interferon-β，IFN-β)產(chǎn)生，從而觸發(fā)腫瘤抗原交叉遞呈和抗腫瘤T細(xì)胞免疫反應(yīng)[5]。激活STING/IRF3/IFN-β通路具有強(qiáng)大的抗癌作用[6]。因此，本研究檢測利多卡因?qū)σ认侔┘?xì)胞PANC-1增殖和凋亡的影響，并探討STING/IRF3/IFN-β通路在整個過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

利多卡因(沈陽光大制藥有限公司)；注射用鹽酸吉西他濱(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司)；人胰腺癌PANC-1細(xì)胞(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫)；細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(cell count kit 8，CCK-8)和ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和IFN-β酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；TRIzol(美國Invitrogen公司)；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒(大連TaKaRa公司)；Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Ultra SYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]；STING、IRF3、Akt、Caspase-3和GAPDH引物由大連TaKaRa公司設(shè)計并合成；RIPA裂解液(北京索萊寶生物技術(shù)公司)；STING、IRF3、磷酸化IRF3(p-IRF3)、Akt、Caspase-3和GAPDH抗體(美國Santa Cruz公司)；BD FACSVerse流式細(xì)胞儀(美國BIO-RAD公司)；辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記山羊抗IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Real-time PCR擴(kuò)增儀(美國ABI公司)；DYCZ-24EN雙垂直電泳槽和WD-9413C型凝膠成像分析系統(tǒng)(北京六一儀器廠)；Sunrise型全自動酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實驗。實驗分為陰性對照組、利多卡因低、中、高劑量組和陽性對照組。對照組不干預(yù)，利多卡因低、中、高劑量組分別用20、40、80 mg/L利多卡因干預(yù)[7]，陽性對照組用10 mg/L吉西他濱干預(yù)[8]，48 h后進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

細(xì)胞接種于96孔板，干預(yù)44 h后加入CCK-8(10 μL/孔)，培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀檢測490 nm處光密度(OD)，細(xì)胞增殖率(%)=(實驗組OD-空白孔OD)/(陰性對照組OD-空白組OD)×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

細(xì)胞接種于6孔板，干預(yù)48 h后收獲細(xì)胞，用PBS洗滌2次，分別加入5 μL膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC和碘化丙啶，充分混勻后室溫避光孵育20 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附法檢測TNF-α和IFN-β水平

細(xì)胞接種于6孔板，干預(yù)48 h后收獲細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入1 mL PBS，細(xì)胞超聲破碎儀處理30 s，離心后收集上清液。將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入孔中，并與TNF-α和IFN-β抗體進(jìn)行預(yù)孵育。2 h后，與HRP偶聯(lián)物孵育30 min，用酶標(biāo)儀測量450 nm處OD。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算TNF-α和IFN-β水平。

1.6 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測STING、IRF3、Akt和Caspase-3 mRNA水平

細(xì)胞接種于6孔板中，干預(yù)48 h后收獲細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入1 mL TRIzol提取總RNA，根據(jù)Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，再根據(jù)Ultra SYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒說明，制備20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件93 ℃預(yù)變性40 s；93 ℃變性10 s，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，共循環(huán)50次，然后72 ℃延長7 min，采用2-ΔΔCt法計算STING、IRF3、Akt和Caspase-3 mRNA相對表達(dá)量(以GAPDH為內(nèi)對照)。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 蛋白印跡法檢測STING、IRF3、Akt、Caspase-3蛋白水平

細(xì)胞接種于6孔板，干預(yù)48 h后收獲細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入RIPA裂解液(200 μL)，裂解2 h后離心取上清，電泳(20 μg/孔)，切膠、轉(zhuǎn)膜后，將膜與STING(1∶500)、IRF3(1∶400)、p-IRF3(1∶200)、Akt(1∶200)和Caspase-3(1∶400)進(jìn)行孵育，4 ℃過夜，用PBS洗滌2次，將膜與辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記山羊抗IgG(1∶10 000)在室溫下孵育30 min，用PBS洗滌2次，顯色，采集圖像進(jìn)行分析(以GAPDH為內(nèi)對照)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 利多卡因?qū)?xì)胞增殖和凋亡的影響

與陰性對照組比較，其余各組細(xì)胞增殖率降低，細(xì)胞凋亡率增加，且利多卡因組隨利多卡因劑量增加呈劑量效應(yīng)關(guān)系，但效應(yīng)不及陽性對照組(P<0.05；表2和圖1)。

表2 利多卡因?qū)ANC-1細(xì)胞增殖和凋亡的影響(n=3) 單位：%

圖1 利多卡因?qū)ANC-1細(xì)胞凋亡的影響

2.2 利多卡因?qū)NF-α和IFN-β水平的影響

與陰性對照組比較，其余各組細(xì)胞TNF-α水平降低，IFN-β水平增加，且利多卡因組隨利多卡因劑量增加呈劑量效應(yīng)關(guān)系，但效應(yīng)不及陽性對照組(P<0.05；表3)。

表3 利多卡因?qū)ANC-1細(xì)胞TNF-α和IFN-β水平的影響(n=3) 單位：ng/L

2.3 利多卡因?qū)TING、IRF3、Akt和Caspase-3 mRNA水平的影響

與陰性對照組比較，其余各組細(xì)胞Akt mRNA水平降低，STING、IRF3和Caspase-3 mRNA水平增加，且利多卡因組隨利多卡因劑量增加呈劑量效應(yīng)關(guān)系，但效應(yīng)不及陽性對照組(P<0.05；圖2和圖3)。

圖2 利多卡因?qū)TING、IRF3、Akt和Caspase-3 mRNA水平的影響a為P<0.05，與陰性對照組比較；b為P<0.05，與利多卡因低劑量組比較；c為P<0.05，與利多卡因中劑量組比較；d為P<0.05，與利多卡因高劑量組比較。

圖3 PANC-1細(xì)胞STING、IRF3、Akt和Caspase-3的溶解曲線

2.4 利多卡因?qū)TING、IRF3、Akt和Caspase-3蛋白水平的影響

與陰性對照組比較，其余各組細(xì)胞Akt蛋白水平降低，STING、p-IRF3/IRF3和Caspase-3蛋白水平增加，且利多卡因組隨利多卡因劑量增加呈劑量效應(yīng)關(guān)系，但效應(yīng)不及陽性對照組(P<0.05；圖4)。

圖4 利多卡因?qū)ANC-1細(xì)胞STING、IRF3、p-IRF3、Akt和Caspase-3蛋白水平的影響a為P<0.05，與陰性對照組比較；b為P<0.05，與利多卡因低劑量組比較；c為P<0.05，與利多卡因中劑量組比較；d為P<0.05，與利多卡因高劑量組比較。

3 討 論

腫瘤細(xì)胞可以通過多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)在和外在機(jī)制逃脫宿主的免疫反應(yīng)，從而增強(qiáng)免疫療法的抵抗力。胰腺癌的免疫原性特別低，可能是由于存在廣泛的纖維炎性和細(xì)胞增殖，造成CD8+T細(xì)胞浸潤[9]。在胰腺癌的麻醉和術(shù)后疼痛治療中給予的藥物，如氯胺酮、羅匹卡伐因和利多卡因，均具有一定抗腫瘤效果[10]。值得注意的是，初步研究表明，利多卡因可改善胰腺癌患者的預(yù)后[11]。本研究結(jié)果顯示，利多卡因能抑制PANC-1細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用，與國內(nèi)外研究一致。吉西他濱單藥治療目前是國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)專家組推薦的一線治療方案，但大多數(shù)胰腺癌患者對吉西他濱耐藥[12]。雖然利多卡因的抗腫瘤細(xì)胞增殖作用不如吉西他濱，但考慮到吉西他濱的耐藥性，對利多卡因的抗腫瘤作用進(jìn)行研究還是很有必要。

目前利多卡因的抗腫瘤作用機(jī)制尚不清楚，特別是在免疫調(diào)節(jié)方面，近年來，免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint blockade，ICB)已成為一種很有前途的治療方法。已有研究提示，利多卡因可通過炎癥細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤浸潤[13]。本研究結(jié)果顯示，利多卡因可降低PANC-1細(xì)胞TNF-α水平，這可以解釋利多卡因抑制胰腺PANC-1細(xì)胞增殖的能力。STING/IRF3/IFN-β通路通過誘導(dǎo)IFN和其他促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[14]。cGAS在自身DNA與炎癥信號傳遞中起著重要作用。來自細(xì)胞核中的游離DNA可以通過cGAS激活STING，進(jìn)而招募TBK1。TBK1以腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6依賴的方式抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB的激活[15]；同時，TBK1可以直接誘導(dǎo)IRF3的激活，誘導(dǎo)IFN-β產(chǎn)生[16]。IFN-β可以抑制免疫細(xì)胞的活力和功能，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，最終抑制TNF-α和白細(xì)胞介素等炎癥因子的產(chǎn)生，從而參與炎性反應(yīng)的調(diào)控[17]。2′3′-cGAMP是STING通路的第二信使，直接與STING結(jié)合并激活STING，2′3′-cGAMP能抑制腫瘤生長，延長荷瘤小鼠的生存時間，在胰腺癌中2′3′-cGAMP已被證明可以調(diào)節(jié)免疫抑制腫瘤微環(huán)境并減輕腫瘤負(fù)擔(dān)[18]。本研究結(jié)果顯示，利多卡因可以激活STING/IRF3/IFN-β通路，為利多卡因治療胰腺癌提供了理論支撐。

人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)/Akt信號已被證明負(fù)調(diào)控STING通路，利多卡因被證明可以抑制腫瘤細(xì)胞HER2/Akt信號[19]。HER2/Akt信號參與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和凋亡調(diào)控。作為HER2/Akt信號的下游信號分子，Akt在許多類型的腫瘤中持續(xù)被高度激活[20]。本研究結(jié)果顯示，利多卡因通過抑制Akt的激活來增強(qiáng)STING表達(dá)，揭示了利多卡因介導(dǎo)STING通路激活的機(jī)制。Caspase的激活介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的凋亡過程，而Caspase-3是凋亡中的重要啟動子。Caspase-3的激活影響主要的結(jié)構(gòu)蛋白并激活其他酶，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[21]。重要的是，Akt信號通路可以抑制裂解的Caspase-3活性[22]。本研究結(jié)果顯示，利多卡因通過促進(jìn)Caspase-3的激活誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡。

綜上所述，利多卡因通過激活STING/IRF3/IFN-β通路，抑制PANC-1細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，抑制PANC-1細(xì)胞增殖并促進(jìn)PANC-1細(xì)胞凋亡，為利多卡因治療胰腺癌提供了理論依據(jù)，但后續(xù)還需大量體內(nèi)和體外研究來驗證利多卡因治療胰腺癌的具體機(jī)制和作用療效。