右美托咪定聯(lián)合布比卡因通過cAMP/PKA-CREB-BDNF信號通路對大鼠坐骨神經阻滯效果的影響

鄭龍蛟， 王志萍

(1.徐州醫(yī)科大學江蘇省麻醉學重點實驗室，江蘇省徐州市 221009；2.無錫市惠山區(qū)人民醫(yī)院麻醉科，江蘇省無錫市 214000；3.徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院麻醉科，江蘇省徐州市 221000)

全身麻醉聯(lián)合超聲引導下區(qū)域神經阻滯能有效降低術中麻醉藥物用量，并減少不良反應。局部麻醉藥在區(qū)域神經阻滯中的作用時間有限，且高劑量容易誘發(fā)神經毒性[1]。臨床上為延長神經阻滯作用時間，嘗試聯(lián)合腎上腺素及可樂定等其他局部麻醉輔助藥物以增強外周神經阻滯效果[2]。右美托咪定通過激活中樞神經α2受體發(fā)揮鎮(zhèn)靜及鎮(zhèn)痛作用，且對中樞呼吸抑制程度較小，臨床運用廣泛[3]。多項研究顯示，局部麻醉藥聯(lián)合右美托咪定不但可以提高蛛網膜下腔和硬膜外阻滯效果，也可以延長外周神經阻滯作用時間，加快神經阻滯效果，改善術后鎮(zhèn)痛作用[4-5]。本研究分析右美托咪定聯(lián)合布比卡因對大鼠坐骨神經阻滯效果并探討其作用機制。

1 材料和方法

1.1 動物及分組

選取SPF級健康成年雄性SD大鼠36只，8～10周齡，體質量180～220 g，由南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。將其隨機分為4組：假手術組(Sham組)、布比卡因組(Bup組)、右美托咪定+布比卡因組(Dex組)和毛喉素+右美托咪定+布比卡因組(Fors組)，每組9只。

所有大鼠均參照文獻[6]制備大鼠坐骨神經阻滯模型。吸入2%～3%七氟醚麻醉下，俯臥位固定、備皮、消毒。于股骨內測坐骨神經結節(jié)處向遠端方向切開皮膚，鈍性分離各層肌肉組織，暴露股二頭肌，充分暴露坐骨神經及其3個分支。選擇坐骨神經周圍為注射點，分別對Bup組、Dex組及Fors組大鼠注射0.5%布比卡因0.2 mL、1.0%布比卡因0.1 mL+6 μg/kg右美托咪定0.1 mL、1.0%布比卡因0.1 mL+6 μg/kg右美托咪定0.1 mL+毛喉素0.1 mL。其中Fors組先注射0.1 mL毛喉素，10 min后再注射右美托咪定和布比卡因，其他3組均加入0.1 mL二甲基亞砜(DMSO)注射，Sham組注射0.2 mL生理鹽水。注射完畢后逐層縫合切口，并以抗生素消毒傷口預防感染，整個操作過程約10 min。術畢放入飼養(yǎng)籠，分別于大鼠復位反射恢復后按時間點進行指標觀察。

1.2 大鼠熱刺激縮足反應潛伏期測定

采用KW-RB型智能熱板測痛儀(南京卡爾文生物公司)于阻滯前及阻滯后10、20、30、60、120、180、240、300、360 min進行大鼠右后肢熱踏板試驗，溫度55 ℃，按照先左后右順序交替測定后足熱刺激縮足反應潛伏期(paw withdrawal thermal latency，PWTL)[7]，每只后肢重復3次，間隔5 min，取平均值。為避免組織損傷，監(jiān)測時間設定為10 s，如果超過10 s仍然未出現(xiàn)縮足反應，則停止刺激，PWTL記為10 s。計算最大效應百分比(maximum percentage effect，MPE)來反應感覺阻滯程度，其中基礎PWTL以阻滯前的PWTL為基線值。MPE(%)=[(給藥后PWTL-基礎PWTL)/(10-基礎PWTL)]×100%。

1.3 大鼠后肢伸姿推力測定

于阻滯前及阻滯后10、20、30、60、90、120、150、180 min進行大鼠后肢伸姿推力(elevated posture thrust，EPT)測定[8]：將大鼠直立上提，保持后肢伸展姿勢，以便遠端足趾和足尖支撐體質量，置于電子秤上方，大鼠后肢伸展所顯示的數(shù)值即為EPT(g)。

1.4 免疫組化

坐骨神經阻滯后12 h，取各組大鼠3只，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，4%多聚甲醛灌注大鼠，分離并取L4～L6節(jié)段脊髓，經多聚甲醛后浸泡固定24 h，再進行蔗糖梯度脫水后，置入恒冷箱切片機進行冠狀冰凍切片(30 μm)，冰凍切片室溫晾干15 min后置于含10%正常山羊血清的PBS中室溫封閉1 h，SP法免疫組化實驗檢測環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、磷酸化環(huán)磷酸腺苷反應元件結合蛋白(phosphorylated cyclic adenosine monophosphate response element binding protein，p-CREB)和腦源性神經營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)的表達水平。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結 果2.1 大鼠各時點MPE、EPT的比較

Bup組和Fors組在阻滯后10～180 min，Dex組在阻滯后10～360 min MPE較Sham組明顯升高(P<0.05)；Dex組在阻滯后10～360 min MPE較Bup組明顯升高(P<0.05)；Fors組在阻滯后的10～360 min MPE較Dex組明顯降低(P<0.05；表1)。Bup組在阻滯后10～90 min，Dex組和Fors組在阻滯后10～120 min EPT較Sham組明顯降低(P<0.05)；Dex組和Fors組在阻滯后10～120 min EPT較Bup組降低(P<0.05；表2)。

表1 各組大鼠各時點MPE的比較 單位：%

表2 各組大鼠各時點EPT的比較 單位：g

2.2 各組大鼠脊髓cAMP、PKA、p-CREB和BDNF的表達

與Sham組比較，其他3組cAMP、PKA、p-CREB和BDNF的表達水平均下降(P<0.05)；與Bup組比較，Dex組各指標較Bup組降低(P<0.05)；Fors組各指標表達水平較Dex組明顯升高(P<0.05；圖1)。

圖1 各組大鼠脊髓中cAMP、PKA、p-CREB和BDNF蛋白表達水平A為典型免疫組織圖(SP法，40×)；B為蛋白表達水平的柱狀統(tǒng)計圖。a為P<0.05，與Sham組比較；b為P<0.05，與Bup組比較；c為P<0.05，與Dex組比較。

3 討 論

臨床發(fā)現(xiàn)單次給予局部麻醉藥物產生的神經阻滯時效相對短暫，而穿刺部位連續(xù)給藥以及增加藥物劑量雖然可延長神經阻滯時間，但存在誘發(fā)神經毒性和感染等并發(fā)癥的風險。有報道指出[9-10]，通過聯(lián)合使用局部麻醉藥物佐劑包括阿片類或α2受體激動劑等可以提高中樞神經及周圍神經阻滯的效果及延長阻滯時間。Singh等[11]的臨床研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定聯(lián)合羅哌卡因可以延長尺神經阻滯的持續(xù)時間。而本研究結果顯示，相比單獨使用布比卡因，右美托咪定聯(lián)合布比卡因可以延長大鼠坐骨神經阻滯的持續(xù)效果和時間，增強鎮(zhèn)痛效能。

右美托咪定具有抑制感覺神經元超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子(hyperpolarization cyclic nucleotide，HCN)電流的作用，以此降低神經元興奮性，達到鎮(zhèn)痛效果[12]。Parsons等[13]報道，當胞內cAMP水平增加時，可直接作用HCN通道，并引起通道的半數(shù)激活電位向去極化方向偏移，以增強神經元興奮性。而毛喉素是cAMP類似物，可以刺激哺乳動物細胞內腺苷酸環(huán)化酶活化，從而促進細胞內cAMP水平升高。本文結果顯示，相比sham組，其余3組在阻滯后的一段時間內MPE明顯升高，EPT明顯降低，說明3個干預組均成功阻斷了坐骨神經的傳導功能；相比Dex組，加入毛喉素的Fors 組大鼠MPE 明顯縮短，MPE的縮短意味著神經反射靈敏度升高，表明毛猴素能夠抑制右美托咪定對坐骨神經的阻滯作用，同時也說明cAMP介導的HCN通道是右美托咪定的鎮(zhèn)痛靶點之一。

史艷燕等[14]研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可以通過降低BDNF和NF-κB的表達緩解神經病理性疼痛。在中樞神經系統(tǒng)疼痛傳導過程中，BDNF的表達量不僅僅在初級傳入神經元中有所增加，在二級傷害感受神經元中也有所增加。BDNF作為疼痛的介質或調節(jié)劑，用于調節(jié)感覺神經元的生長和存活。本文單獨注射布比卡因降低脊髓中cAMP、PKA、p-CREB和BDNF的表達水平，而右美托咪定聯(lián)合布比卡因有助于促進cAMP/PKA-CREB-BDNF信號通路的抑制。提示該信號通路可能參與了右美托咪定延長阻滯時效的機制。

綜上所述，右美托咪定聯(lián)合布比卡因相比單獨使用布比卡因，延長了大鼠坐骨神經感覺和運動阻滯效果和持續(xù)時間，且延長運動阻滯時效的機制與抑制cAMP/PKA-CREB-BDNF信號通路有關。