葛根素通過Sirt3/AMPK信號通路改善奧氮平誘導的大鼠糖脂代謝紊亂

王裕紅

(瓊海市中醫院藥劑科，海南省瓊海市 571400)

奧氮平是一線抗精神疾病用藥，其引起的肥胖及糖脂代謝紊亂問題日益突出[1-2]。目前網絡信息學研究發現，中藥具有多成分、多靶點網絡調控作用，而中藥單體作為中草藥的活性成分，因具有多種藥用特性成為新藥開發的重要來源[3]。葛根素是中藥葛根的活性成分，有抗氧化、退熱、鎮靜及降脂降糖等作用[4]。既往雖有研究證實葛根素具有調節糖脂代謝作用，但相關機制研究并未深入。本研究主要探討葛根素對奧氮平誘導的大鼠糖脂代謝紊亂模型的影響及對細胞信號代謝通路——沉默調節蛋白3(recombinant sirtuin 3，Sirt3)/腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase，AMPK)的調節作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠60只，雄性，體質量(200±20)g，由中國食品藥品檢定研究院提供，許可證號：SCXK(京)2019-0017。飼養溫度(22±2)℃，相對濕度(50±10)%，滅菌普通飼料喂養。動物實驗參照3R原則。

1.2 試劑和儀器

葛根素(江蘇恩鳴生物工程科技有限公司，純度為98%)，奧氮平(江蘇豪森藥業集團有限公司)；二甲雙胍腸溶片(北京利齡恒泰藥業有限公司)，3-TYP(Sirt3抑制劑，上海源葉生物科技有限公司，純度為98%)。

BCA蛋白試劑盒、蛋白抽提RIPA裂解液、上樣緩沖液(武漢博士德生物工程有限公司)，Sirt3、AMPKα、磷酸化AMPK(p-AMPK)、ACC和p-ACC一抗、β-actin(Abcam中國)，HRP標記的兔抗羊IgG(美國CST公司)。血糖試紙(美國強生公司)、石蠟切片機(德國徠卡公司)，高速冷凍離心機(美國Sigma公司)。

1.3 糖脂代謝紊亂模型建立及分組方法[5-6]

大鼠適應性飼養1周，隨機分為對照組、3-TYP組、模型組、葛根素組、葛根素+3-TYP組和陽性藥物組，10只/組。除對照組和3-TYP組外，各組均以奧氮平2.5 mg/kg灌胃，2次/天，連續4天，第5天起調整劑量為12.5 mg/kg，2次/天，對照組和3-TYP組則以等量生理鹽水灌胃。第15天起葛根素組以葛根素每天400 mg/kg灌胃；3-TYP組以每天3-TYP 50 mg/kg灌胃；葛根素+3-TYP組在葛根素組基礎上以每天3-TYP 50 mg/kg灌胃；陽性藥物組以二甲雙胍腸溶片0.2 g/kg灌胃，2次/天；對照組和模型組則以生理鹽水灌胃，連續干預56天，實驗期間自由進食飲水。

1.4 稱量法檢測Lee’s指數及FBG檢測

于末次給藥后第2天檢測各組體質量及空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)，測量各組大鼠體質量(電子天平測量)及體長(鼻至肛門長度)，計算Lee’s指數[Lee’s指數=(體質量/體長)1/3]。FBG檢測前禁食、禁水8 h，尾尖采血，血糖儀檢測FBG。

1.5 酶法檢測血脂指標

FBG檢測后大鼠以1%戊巴比妥鈉35 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥固定于操作臺面，取腹主動脈血，置于EDTA抗凝試管中，離心分離血漿，檢測量總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipid-cholesterol，HDLC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipid-cholesterol，LDLC)。

1.6 稱量法檢測脂肪濕重并計算脂肪系數

取血后，分離大鼠肝臟、心臟、腎臟(內臟脂肪)與腹股溝脂肪組織(皮下脂肪)，稱重，計算脂肪濕重和脂肪系數。脂肪系數(%)=脂肪濕重/體質量×100%。

1.7 Western blotting法檢測脂肪組織Sirt3/AMPK信號通路蛋白表達

取大鼠脂肪組織，加入裂解液裂解，冰上靜置10 min，離心取上層，加入2×上樣緩沖液，水浴加熱5 min蛋白變性，以BCA試劑盒測量蛋白水平，SDS-PAGE法分離，轉移至PVDF膜，加入一抗，4 ℃封閉過夜，加入二抗，室溫下孵育2 h，ECL化學發光顯影、定影，拍照，以Quantity One圖像分析軟件分析目的蛋白表達情況。

1.8 統計學方法

以SPSS 26.0軟件進行數據分析，計量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠Lee’s指數及FBG比較

與對照組比較，3-TYP組Lee’s指數和FBG均升高(P<0.05)；與3-TYP組比較，模型組Lee’s指數和FBG均升高(P<0.05)；與模型組比較，葛根素組Lee’s指數和FBG均降低(P<0.05)；與葛根素組比較，葛根素+3-TYP組Lee’s指數和FBG均升高(P<0.05)；與葛根素+3-TYP組比較，陽性藥物組的Lee’s指數和FBG降低(P<0.05；表1)。

表1 各組大鼠Lee’s指數及FBG比較(n=10)

2.2 各組大鼠血脂指標比較

與對照組比較，3-TYP組TC、TG、LDLC均升高，HDLC均降低(P<0.05)；與3-TYP組比較，模型組TC、TG、LDLC均升高，HDLC均降低(P<0.05)；與模型組比較，葛根素組TC、TG、LDLC均降低，HDLC均升高(P<0.05)；與葛根素組比較，葛根素+3-TYP組TC、TG、LDLC均升高，HDLC均降低(P<0.05)；與葛根素+3-TYP組比較，陽性藥物組TC、TG、LDLC均降低，HDLC均升高(P<0.05;表2)。

表2 各組大鼠血脂指標比較(n=10) 單位：mmol/L

2.3 各組大鼠脂肪濕重及脂肪系數比較

與對照組比較，3-TYP組脂肪濕重與脂肪系數均升高(P<0.05)；與3-TYP組比較，模型組脂肪濕重與脂肪系數均升高(P<0.05)；與模型組比較，葛根素組脂肪濕重與脂肪系數均降低(P<0.05)；與葛根素組比較，葛根素+3-TYP組脂肪濕重與脂肪系數均升高(P<0.05)；與葛根素+3-TYP組比較，陽性藥物組脂肪濕重與脂肪系數均降低(P<0.05；表3)。

表3 各組大鼠肪濕重及脂肪系數比較(n=10)

2.4 各組大鼠脂肪組織Sirt3/AMPK信號通路蛋白表達比較

與對照組比較，3-TYP組Sirt3蛋白表達及p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC均降低(P<0.05)；與3-TYP組比較，模型組Sirt3蛋白表達及p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC均升高(P<0.05)；與模型組比較，葛根素組Sirt3蛋白表達及p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC均升高(P<0.05)；與葛根素組比較，葛根素+3-TYP組Sirt3蛋白表達及p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC均降低(P<0.05)；與葛根素+3-TYP組比較，陽性藥物組Sirt3蛋白表達及p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC均升高(P<0.05；圖1和圖2)。

圖1 大鼠脂肪組織Sirt3/AMPK信號通路蛋白Western blotting圖A為對照組；B為3-TYP組；C為模型組；D為葛根素組；E為葛根素+3-TYP組；F為陽性藥物組。

圖2 各組大鼠脂肪組織Sirt3蛋白表達及p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC比較a為P<0.05，與對照組比較；b為P<0.05，與3-TYP組比較；c為P<0.05，與模型組比較；d為P<0.05，與葛根素組比較；e為P<0.05，與葛根素+3-TYP組比較。

3 討 論

研究證實，精神疾病患者治療期間出現的體質量增加、糖尿病及TG的升高與第2代抗精神疾病藥物的使用有關，并能進一步增加精神疾病患者心腦血管疾病患病風險，影響抗精神疾病治療的依從性及轉歸[7-8]。因此及時處理抗精神疾病藥物導致的糖脂代謝紊亂對于患者的轉歸有重要意義。

葛根素是從中藥葛根中分離出的異黃酮類衍生物，具有免疫保護、抗氧化、改善微循環、擴張血管、抗癌等多種作用[9]。研究表明，葛根素能改善動脈粥樣硬化大鼠血脂異常，發揮降脂、抗炎的作用，并可改善糖尿病小鼠胰島β細胞功能，有一定的降糖作用[10-11]。本研究結果顯示，經3-TYP干預后，大鼠Lee’s指數、FBG、TC、TG、LDLC、HDLC、脂肪濕重與脂肪系數等指標與對照組差異存在顯著性，說明抑制Sirt3的表達可影響大鼠糖脂代謝；經葛根素干預后上述代謝指標得到改善，且聯合3-TYP干預對代謝指標的改善作用減弱提示葛根素可改善奧氮平所致的大鼠糖脂代謝紊亂狀態，抑制Sirt3能降低葛根素對糖脂代謝紊亂的改善作用。

Sirt3/是作用于細胞代謝調節關鍵環節的信號通路，在肥胖及其他代謝疾病的研究中日益受到重視。Sirt3是一種依賴煙酰胺二核糖核苷的去乙酰化酶，具有調節線粒體氧化應激、能量代謝、凋亡等病理生理過程的作用[12-13]。AMPK是細胞的能量調節器，能在蘇氨酸172位點發生磷酸化激活調節糖脂代謝[14]。ACC是AMPK重要的下游分子，存在于各類合成脂類的組織和發生氧化應激反應的線粒體中，在脂肪酸的代謝過程中有重要作用[15]。研究證實[16]，活化的AMPK可通過磷酸化下游ACC，抑制其活性，在細胞層面和整體層面調控機體能量平衡。本研究結果中顯示，經葛根素干預后的大鼠Sirt3蛋白表達及p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC均升高，聯合3-TYP干預后Sirt3蛋白表達及p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC升高水平下降。說明Sirt3/AMPK信號通路參與奧氮平引起的糖脂代謝紊亂的發生，而葛根素可增加Sirt3蛋白表達，提高AMPK、ACC的磷酸化活性。

綜上所述，葛根素可改善奧氮平誘導的大鼠糖脂代謝紊亂，其機制可能與激活Sirt3蛋白表達，提高AMPK、ACC的磷酸化活性有關。