M2巨噬細胞對新生乳鼠受損心臟組織的再生和修復機制

王 茜 張家坤 劉 青 孫 琳 李晶潔*

(1.哈爾濱醫科大學附屬第四醫院胸痛中心，哈爾濱 150001；2.天津市寶坻區人民醫院心內科，天津 301800；3.哈爾濱醫科大學附屬第一醫院心內科二病房，哈爾濱 150001)

心臟受損后心肌組織的再生和修復效率低下是造成大部分心臟疾病的原因之一，嚴重者短時間內就會出現心力衰竭，而心力衰竭正是世界范圍內造成人類死亡的一個主要原因[1]。在新生哺乳動物[2-10]，如乳鼠[4-8]和豬[9-10]中，在出生后7 d內心臟保留了將損傷心肌組織完全修復的能力，但成年哺乳動物中心臟的這種再生修復能力完全喪失。Porrello等[5]在2011年發現新生乳鼠心臟切除10%的心尖后依然具有完全再生的能力，且最近國內外多項研究[11-12]證實7 d內新生乳鼠的心臟具有再生能力，可以將其作為哺乳動物心臟再生的研究模型。在新生心肌損傷后的修復過程中免疫反應起著至關重要的作用[13-21]，其中巨噬細胞的作用更是無可替代，盡管其潛在機制尚不完全清楚[22]。

巨噬細胞作為一種可塑性強的細胞群[23-25]，參與了多個器官(如腸道、肺和皮膚等)的炎性反應和傷口愈合，可對心肌損傷后的環境信號作出相應反應，極化為兩個功能不同的亞群，即經典活化型(M1)巨噬細胞和交替活化型(M2)巨噬細胞。心肌梗死(myocardial infarction，MI)后，M1和M2巨噬細胞均出現在受損的心肌組織中。早期炎性反應階段，M1巨噬細胞通過分泌大量促炎因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-6等浸潤心肌損傷區[16，18，26-27]，表現出強烈的促炎性反應表型。M1和中性粒細胞、單核細胞等降解并清除壞死的碎片和凋亡細胞，這是組織修復的必要準備。然而，如果促炎反應變得過度或不受控制，它將導致嚴重的炎性反應并抑制愈合過程。而M2巨噬細胞具有完全相反的功能，它可以抑制炎性反應和修復受損組織。M2巨噬細胞激活成纖維細胞，導致纖維化瘢痕形成，增強脆弱的心室壁[28-30]。因此，隨著M1巨噬細胞增加的減少，心臟中M2巨噬細胞的數量增加，在MI[6-10，31]后第5～7天達到峰值。這種細胞還能在受損的心肌組織中誘導血管和交感神經生成。

M2巨噬細胞也參與誘導缺血組織中的新生血管形成。近年來多項研究[32-33]證實乳鼠心臟再生與神經、血管的形成以及細胞外基質等有關。通過RNA修飾技術促進血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達，可以增強鼠心肌梗死后心臟再生能力，提示血管生成在心臟再生時發揮重要作用。White等[33]及Mahmoud等[34]通過手術切除迷走神經或者用6-羥基多巴胺氫溴酸鹽(6-hydroxydopamine hydrobromide，6-OHDA)化學消融交感神經證實抑制交感神經再生可以削弱心臟損傷后再生的能力，而靶器官中神經生長因子(nerve growth factor，NGF)的表達程度決定了交感神經的支配密度[19]。這些研究[33-34]表明神經可能通過NGF參與心臟再生，但M2巨噬細胞能否通過影響神經及血管的新生促進心臟再生目前尚不清楚。因此，本研究應用乳鼠心尖切除模型研究巨噬細胞極化在哺乳動物心臟再生中的作用及部分機制，旨在揭示心臟再生時不同巨噬細胞的功能及其對血管和神經再生的影響，并進一步探究M2巨噬細胞在神經及血管再生方面的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康6～8周齡SD雄性大鼠以及同系源出生后第1天(P1)和第7天(P7)新生SD乳鼠，取自哈爾濱醫科大學第二附屬醫院實驗動物中心[實驗動物許可證號：SCXK(黑)2019-001]。所有動物實驗相關操作均按照機構動物護理指南進行，并經哈爾濱醫科大學第一附屬醫院實驗動物管理委員會倫理審批，倫理審批號：2020044。動物被飼養在一個特定的無病原體動物設施中，在12 h的光-暗循環中自由獲得食物和水。

1.2 試劑與抗體

ACK紅細胞裂解液購自Solarbio公司(中國)；粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)、TNF-α抗體及IL-4抗體購自Peprotech公司(美國)；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)溶液、胰蛋白酶-EDTA購自Every Green公司(美國)；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)抗體購自Sigma公司(日本)；RNA提取試劑盒購自Axygen公司(美國)；cDNA反轉錄試劑盒購自Roche公司(瑞士)；酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)抗體、CD34抗體、NGF抗體、TH抗體、CD34抗體購自Boster公司(中國)，VEGF抗體購自Bioss公司(中國)，IgG-HRP二抗購自Zsbio公司(中國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 骨髓源性巨噬細胞的分離、培養和極化

原代細胞的分離和培養嚴格按照無菌程序進行，避免污染。采用頸椎脫位法處死6～8周齡健康雄性大鼠，固定于手術板上，收集股骨和脛骨放入75%(體積分數)乙醇消毒。割斷長骨的末端，用1×PBS沖洗掉骨髓。用ACK 紅細胞裂解液去除紅細胞后，臺式離心機(Eppendorf公司，德國)在4 ℃下離心30 min分離單核細胞，洗滌，重懸于含有10%(體積分數)熱滅活的FBS，50 U/mL青霉素和50 mg/mL鏈霉素，10 ng/mL GM-CSF的DMEM溶液中，接種于培養皿中，密度為每10 cm培養皿中(每只乳鼠)培養細胞27×106個，并在37 ℃下在含有5%(體積分數)CO2的環境中培養過夜。第2天，將未貼壁或貼壁較弱的細胞回收，轉移到新培養皿中并在上述相同條件下培養，貼壁的細胞被丟棄。每天監測培養情況，并定期補充新鮮培養基。培養7 d后，用PBS輕輕沖洗黏附的骨髓來源的巨噬細胞，并短暫暴露于胰蛋白酶-EDTA中獲得巨噬細胞。LPS和TNF-α溶液培養24 h，使細胞極化至M1巨噬細胞，IL-4 溶液誘導24 h極化為M2巨噬細胞。

1.3.2 新生乳鼠建立心尖切除模型

取出生后第1天(P1)的新生乳鼠行心尖切除術，術后采用數字表法隨機分為3組:對照組(僅手術組)、M1巨噬細胞植入組和M2巨噬細胞植入組。每一組至少有20只新生乳鼠。采用新生的P7乳鼠重復了所有的實驗。

為了檢測極化巨噬細胞對心肌再生和修復的影響，首先通過手術切除P1和P7新生乳鼠的左心室尖(約10%的心室心肌)建立心尖切除模型。切除體積。心尖切除手術模型成功的標志為心室腔暴露，心尖切口處流血，有血細胞聚集、血凝塊形成，堵塞破損的心尖部缺口防止心室腔內的血液繼續外流。

將P1或P7新生乳鼠置于冰床上進行低溫麻醉，后固定于手術操作臺上使乳鼠保持右側臥位，在第四或第五肋間隙平行于肋間隙切開胸腔，鈍性分離皮下組織及肌肉入胸，用顯微手術剪剪除提起的心尖部肌肉組織，手術成功的標準為暴露出左心室腔，切除約10%心室心肌。切除結束時，將0.05 mL M1巨噬細胞局部注射到心尖切除部位作為M1巨噬細胞植入組，將0.05 mL M2巨噬細胞局部注射到心尖切除部位作為M2巨噬細胞植入組(圖1)，行心尖切除術但未植入巨噬細胞的作為對照組。手術后，縫合切口，并對新生乳鼠進行復溫，使其完全恢復生命體征平穩。術后7 d，收集各組心臟組織進行組織學和分子分析。

圖1 新生乳鼠左心尖手術切除示意圖

1.3.3 實時聚合酶鏈反應

使用RNA提取試劑盒從巨噬細胞或心肌組織中提取總RNA。用分光光度計測定RNA樣品的數量和純度。cDNA由羅氏第一鏈合成試劑盒反轉錄。采用實時熒光定量技術在梯度PCR儀器(賽默飛世爾科技公司，美國)上進行實時PCR。每個靶點的表達水平與管家基因β-actin或GAPDH的mRNA水平進行對照。

引物序列如下：CD163，正向: 5′-GGATTGCCCTATGACTGCTCT-3′，反向: 5′-TTGGACCGAAGATGATGAACTAC-3′;CD86，正向: 5′-GCTCGTAGTATTTTGGCAGGAC C-3′，反向: 5′-CGGGTATCCTTGCTTAGATGAGC-3′;β-actin，正向: 5′-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′，反向: 5′-CGGACTCATCGTACTCCTGCT-3′;IL-6，正向: 5′-AGAAGACCAGAGCAGATTTT-3′，反向: 5′-GAGAAAAGA GTTGTGCAATG-3′;IL-1β，正向: 5′-GGGATGATGACGA CCTGC-3′，反向: 5′-CCACTTGTTGGCTTATGTT-3′;趨化因子配體-3[chemokine(C-C motif)ligand-3,CCL-3]，正向: 5′-CATGGCGCTCTGGAACGAA-3′，反向: 5′-TG CCGTCCATAGGAGAAGCA-3′;VEGF，正向: 5′-AGAAAG CCCATGAAGTGGTGA-3′，反向: 5′-CTTCATCATTGCAGCAGCCC-3′;NGF，正向: 5′-TCGCTCACTCCACTATCCA CTA-3′，反向: 5′-GACTCAACAGGGCAAGCATAC-3′; GA PDH，正向: 5′-AGATCCACAACGGATACATT-3′，反向:5′-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3′。

1.3.4 HE染色

將新生乳鼠心臟組織固定在10%(質量分數)甲醛溶液中，用不同濃度乙醇(75%、85%、95%，無水)脫水，石蠟包埋，切成5 μm切片，置于載玻片上。隨后常規脫蠟，蘇木精-伊紅染色。玻片脫水后密封，室溫保存。在顯微鏡下觀察并記錄組織學形態。

1.3.5 免疫組織化學

乳鼠心臟組織在10%(質量分數)甲醛和石蠟包埋中固定至少24 h。垂直于心外膜切開4 μm的透壁切片，安裝在帶電載玻片上，按標準程序進行染色。簡言之，將石蠟切片脫蠟并再水化。根據標準程序回收抗原。切片在4 ℃孵育過夜，一抗如下：TH抗體(1∶100)，CD34抗體(1∶100)，VEGF抗體(1∶400)，NGF抗體(NGF，1∶10)。24 h后，沖洗玻片，室溫下用IgG-HRP二抗孵育15 min。采用計算機輔助圖像分析系統(Imagepro Plus 6.0軟件)測定血管、神經、VEGF、NGF密度，計算積分吸光度(integral optical dens，A)平均值。

1.3.6 免疫熒光染色

心臟組織用液氮冷凍，4%(質量分數)多聚甲醛固定，切成10 μm厚的冷凍切片。切片在室溫封閉液中孵育1 h，然后用TH抗體(1∶10)或CD34抗體(1∶10)在4 ℃孵育過夜。PBS沖洗3次，室溫下用含0.5%(體積分數)Triton X-100的PBS溶液稀釋TRITC標記的山羊抗兔IgG(H+L)孵育。1 h后，PBS沖洗3次，DAPI孵育10 min，干燥后蓋上蓋玻片進行評價。使用計算機輔助圖像分析系統(Imagepro Plus 6.0)測量熒光強度。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 M1和M2巨噬細胞的極化和特征

用GM-CSF分離培養大鼠骨髓源性巨噬細胞(bone marrow-derived macrophages，BMDM)7 d。培養后1 d，大部分細胞黏附在培養板上，外觀呈紡錘形、長梭形和多邊形形態。培養7 d，細胞增生良好，保持梭形形態，細胞群呈放射狀排列的同心圓狀生長，這是巨噬細胞的典型生長特征。培養7 d后，分別加入LPS + TNF-α和IL-4，使細胞極化至M1巨噬細胞和M2巨噬細胞。LPS + TNF-α刺激24 h后，細胞呈長梭形，偽足細長，與M1巨噬細胞的形態特征一致。IL-4刺激后，細胞變大變圓，偽足變短，呈現M2巨噬細胞的特征(圖2)。

圖2 M1和M2巨噬細胞體外極化結果

采用反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測極化后的巨噬細胞標志物，其中M1巨噬細胞為CD86，M2巨噬細胞為CD163。與形態變化一致的是，IL-4極化后的細胞顯示出M2巨噬細胞標志物CD163的升高；而M1巨噬細胞的標志物CD68在IL-4的刺激下沒有變化。LPS+TNF-α處理顯著刺激了極化細胞中CD68的表達，而不是CD163的表達(圖2B)。

2.2 M2巨噬細胞促進心臟損傷后心肌再生和修復

術后7 d，一系列的組織學分析顯示，血凝塊首先出現在切除部位，并逐漸被吸收，切除區域心肌組織充盈。新生心肌細胞在P1乳鼠中的排列比在P7新生兒中的排列更有序。在P1乳鼠受損心肌組織中也觀察到較少的炎性反應細胞(圖3A)。

術后7 d心尖切除部位再生心肌組織中，M1巨噬細胞標志物CD68 在M1巨噬細胞植入組檢測到的表達水平明顯高于對照組和M2巨噬細胞植入組；M2巨噬細胞標志物CD163在M2巨噬細胞植入乳鼠中顯著增加，而在其他兩組乳鼠中幾乎不增加(圖2C和2D)。

術后7 d HE染色結果顯示，在P1和P7乳鼠中，M2巨噬細胞的植入顯著改善了心肌的再生和修復(圖3A)。與對照組相比，M2巨噬細胞的植入能顯著促進受損心肌組織的再生和修復，心肌細胞組織有序，免疫細胞浸潤較少，纖維化程度下降。而M1巨噬細胞植入組乳鼠心肌細胞排列紊亂，大量吞噬細胞和淋巴細胞浸潤彌散分布，間質中含鐵血黃素淤積。P1和P7乳鼠組織再生區心肌細胞含量按照M1植入組、對照組和M2植入組的順序而增加；M1巨噬細胞植入組乳鼠的炎性細胞數量呈現相反的順序：M1巨噬細胞植入組>對照組>M2巨噬細胞植入組(圖3A)。

2.3 M2巨噬細胞可抑制心肌組織損傷引起的炎性反應

與對照組相比，M1巨噬細胞植入組乳鼠的3種主要炎性反應因子IL-6、IL-1β和CCL-3濃度顯著升高。然而，M2巨噬細胞植入通過降低IL-6、IL-1β和CCL-3濃度來拮抗炎性反應(圖3B)。

圖3 M2巨噬細胞促進受損心肌組織的再生和修復

2.4 巨噬細胞極化影響血管生成和交感神經支配

P1和P7乳鼠術后7 d M2巨噬細胞植入組均顯著增加新生血管和交感神經數量；M1巨噬細胞植入組乳鼠的組織再生區血管和神經較對照組少。此外，在所有實驗個體中，P1乳鼠在血管和交感神經再生方面表現出比P7乳鼠更強的能力(圖4)。免疫組織學觀察結果表明，P1乳鼠組織再生區交感神經A平均值分別為：對照組252.30±13.56、M1巨噬細胞植入組109.90±5.17、M2巨噬細胞植入組397±14.77，M1、M2兩組與對照組比較，差異有統計學意義；3組血管A平均值分別為：對照組166.7±3.93、M1巨噬細胞植入組93.37±2.52(P<0.05)、M2巨噬細胞植入組243.8±26，M1、M2兩組與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。P7乳鼠組織再生區交感神經A平均值分別為：對照組145.4±3.52、M1巨噬細胞植入組56.03±8.20、M2巨噬細胞植入組216±13.07，M1、M2兩組與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；3組血管A平均值分別為：對照組109.8±6.37、M1巨噬細胞植入組55.51±8.07、M2巨噬細胞植入組169.8±11.91，M1、M2兩組與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖4 M1、M2巨噬細胞植入后7 d，P1和P7乳鼠再生心肌組織血管和交感神經的變化

2.5 M2巨噬細胞通過釋放生長因子促進交感神經支配和血管再生

對P7乳鼠進行心尖切除術，將等量的M2巨噬細胞植入受損心肌組織的損傷區(距切緣1 mm以內)和邊界區(距切緣1～2 mm)。術后7 d，分別測定心尖損傷區和邊界區交感神經和血管的分布。在損傷區，M2巨噬細胞植入可顯著增加血管生成和交感神經支配。對照組和M2巨噬細胞植入組乳鼠血管A平均值分別為188.3±12.41和139.7±5.78，兩組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；對照組和M2巨噬細胞植入組交感神經A平均值分別為576.3±43.32和339.7±23.9，兩組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。在邊界區，M2巨噬細胞植入也觸發了新生血管生成和交感神經支配，但強度較低。對照組和M2巨噬細胞植入組乳鼠邊界區血管A平均值分別為100±2.52和86.33±8.01，兩組比較，差異有統計學意義(P<0.05); 對照組和M2巨噬細胞交感神經A平均值分別為113±5.51和85.67±6.19，兩組比較，差異有統計學意義(P<0.05)(圖5)。

圖5 觀察P7乳鼠切除部位及邊緣區M2巨噬細胞植入后血管及交感神經的變化

組織中VEGF和NGF的濃度，與對照組相比，M2巨噬細胞的植入顯著提高了再生心肌組織中VEGF和NGF濃度，這兩種因子濃度的增加與植入巨噬細胞的數量密切相關(圖6)。

圖6 M2巨噬細胞植入后再生心肌組織中VEGF和NGF變化

3 討論

在新生哺乳動物(如乳鼠和豬)的心臟中，已經觀察到心臟損傷后的有效和完整的再生[4-10]，盡管這種再生能力在出生后一段時間后迅速減弱。然而，在一定條件下，成年哺乳動物心臟也可能保留心肌細胞更新的能力。例如，缺氧預處理的成年小鼠在心肌梗死后[35]有很強的再生反應和更少的纖維化，再生心肌細胞來源于原始心肌細胞。到目前為止，尚不清楚新生哺乳動物心臟為何具有再生潛能，因此，了解啟動心肌再生的關鍵事件對于設計有效修復受損心肌組織從而恢復心功能的新方案至關重要。

巨噬細胞在心肌再生中起著關鍵作用，Aurora等[36]應用巨噬細胞耗竭模型證實巨噬細胞耗盡的新生乳鼠在心肌損傷后無法再生心肌并形成纖維化瘢痕，心臟功能降低。與此觀察一致，本研究中M2巨噬細胞植入有利于心尖切除后心肌再生，心肌再生組織中心肌細胞增多，炎性反應細胞減少，纖維化減少。然而，M1巨噬細胞通過更多的炎性反應細胞、更少的心肌細胞和更強的纖維化抑制心臟再生。這些現象可能與兩種極化巨噬細胞的固有特性有關。M1巨噬細胞是通過分泌炎性反應細胞因子的促炎表型，而M2巨噬細胞具有抗炎功能。事實上，在本研究中，當M1巨噬細胞植入心臟組織時，炎性反應因子IL-1β、IL-6和CCL-3顯著升高；與對照組相比，M2巨噬細胞植入顯著降低了這些炎性反應因子，可能導致更有效的心肌再生和修復。在成人心臟中，M1巨噬細胞數量在心肌梗死后第3天達到峰值，然后M2巨噬細胞數量隨著M1巨噬細胞數量的減少而增加，在心肌梗死后第5～7天[6-10，31]達到峰值。M2巨噬細胞激活成年損傷心臟的成纖維細胞，導致纖維化瘢痕的形成，增強受損心臟的脆弱心室壁[28-30]。M2巨噬細胞有利于新生心臟心肌再生或觸發成年心臟瘢痕形成可能取決于不同的微環境線索，有待進一步研究。

越來越多的證據[5，35]表明，心肌損傷后的再生和修復需要血管新生和交感神經支配。新生哺乳動物心臟損傷后，如心尖切除[5]、冰凍[35]、心肌梗死等，新生血管大量形成，心肌組織再生修復，心肌功能恢復。交感神經支配對心肌再生和修復也是必不可少的，因為去交感神經支配能夠完全抑制新生心臟[31]損傷后的心肌再生。本研究還證實了新生血管和交感神經在P1和P7新生乳鼠心尖切除后的再生組織中的功能是強大的。此外，相比較M1巨噬細胞，M2巨噬細胞植入受損心肌組織后可顯著促進新生血管生成和交感神經支配，導致更強勁的心肌再生和修復。在心肌梗死成年乳鼠中誘導VEGF表達可以誘導血管生成，從而改善組織周轉和心功能恢復[37]。心臟和其他組織中的神經生長因子是決定交感神經系統[38]神經支配密度的關鍵因素，在手術切除的犬心臟[39]中，神經生長因子的增加可以增強交感神經支配。在本研究中，M2巨噬細胞以劑量依賴性的方式顯著誘導損傷組織中VEGF和NGF的升高，這可能有助于M2巨噬細胞介導的心肌再生。

本研究結果表明巨噬細胞極化可能通過調節新生血管和交感神經支配影響新生乳鼠心肌的再生和修復。M2巨噬細胞促進心肌再生；M1巨噬細胞抑制心臟修復。因此，調控巨噬細胞M2/M1比例可能是心肌受損后心肌組織修復的新策略。