基于網絡藥理學和分子對接技術探討續斷促進骨折愈合的機制

張 進 王 東

(1.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院SICU，北京 100020；2.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院骨科，北京 100020)

骨折是造成傷殘的重要原因。由于骨折愈合過程復雜，雖然嚴格按照診療規范進行骨折復位、固定，仍有約10%的患者出現骨折延遲愈合甚至骨折不愈合[1-3]。一旦患者骨折不愈合，往往需要進行二次手術，即使術后骨折愈合，但患者功能恢復困難，嚴重影響生活、工作。尋找促進骨折愈合的方法一直是創傷骨科研究的重點[4-6]。

目前直接促進骨折愈合的生物制劑有限。雖然骨形態發生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)被美國批準用于臨床[7]，但易出現異位骨化，有研究[8-9]顯示，BMP-2會增加術后內固定物失敗，部分患者應用BMP-2后會出現危及生命的并發癥。局部高劑量應用BMP-2會有誘發惡性腫瘤的風險[8]。

續斷是我國傳統中藥，《神農本草經》命名為續斷并沿用至今。續斷又稱川斷、和尚頭，因為可以“續折接骨”所以稱之為“續斷”。《本草經集注》上記載“廣州又有一藤名續斷，一名諾藤，斷其莖，器承其汁飲之，療虛損絕傷，用沐頭，又長發”[10]。

《植物名實圖考》[10]詳細描述了續斷的形態，并進行繪圖備注。描述續斷為“滇中生一種續斷，極似芥菜，亦多刺，與大薊類似。稍端夏出一苞，黑刺如毬，大如千日紅花苞，開花白，宛如蔥花，莖勁，經冬不折，土醫習用。滇蜀密布，疑川中販者即此種，繪之備考，原圖俱別存”。又對之前本草記載進行分析，指出之前記載有誤。

《滇南本草》中對續斷描述為“入肝補肝，強筋骨，走經絡，止經中酸痛，安胎，治婦人白帶，生新血，破瘀血，落死胎，止咳嗽，咳血，治赤白便濁”[10]。續斷促進骨折愈合的研究較多，但是其機制不清，闡明其作用機制，可為臨床推廣續斷治療骨折以及開發新藥物提供研究思路。

本研究采用網絡藥理學以及分子對接技術對續斷促進骨折愈合的機制進行探討。首先根據數據庫分析續斷的有效成分以及篩選其治療骨折的作用基因靶點。然后對基因靶點進行基因本體(gene ontology,GO)、京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析，得到續斷促進骨折愈合的重要信號通路。通過對作用基因靶點進行蛋白互作網絡分析，得到續斷促進骨折愈合的關鍵基因。最后通過分子對接技術驗證續斷調控關鍵基因的機制，以及可能結合的位點。

1 資料與方法

1.1 續斷有效成分篩選以及作用靶點獲取

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索續斷的化學成分，設定口服藥物生物利用度(oral drug bioavailability,OB)≥30%和類藥性指數(drug like index, DL)≥0.18作為篩選續斷有效活性成分的標準[11]。通過該數據庫得到續斷有效活性成分的作用靶點，并利用UniProt(https://www.uniprot.org/)數據庫將作用靶點名稱(target name)轉換成基因名稱(gene name)。

1.2 續斷治療骨折的作用基因靶點篩選

以骨折“bone fracture”作為關鍵詞，在TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、OMIM(http://www.omim.org/)、GeneCards(http://www.genecards.org/)、DrugBank(https://go.drugbank.com/)、PharmGkb(https://www.pharmgkb.org/)等數據庫進行搜索，獲取骨折的相關基因靶點[12-16]。整合上述數據庫的骨折靶點，刪除重復基因。將續斷有效成分的作用基因靶點與骨折的相關基因靶點進行匹配，獲取交集。通過EVenn(http://www.ehbio.com/test/venn/#/)軟件繪制韋恩圖[17]。

1.3 續斷治療骨折的作用基因靶點GO以及KEGG富集分析

將獲取的續斷治療骨折的作用基因靶點導入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/，Version 6.8)數據庫，設定種屬為人類，進行GO以及KEGG富集分析[18-19]。獲取續斷治療骨折的作用基因靶點參與的生物學過程、分子功能、細胞成分、信號通路。

1.4 續斷治療骨折的蛋白互作網絡構建以及關鍵基因篩選

將續斷治療骨折的作用基因靶點導入STRING 11.5(https://www.string-db.org/)數據庫[20-21]。設定相互作用最低值為0.4，構建續斷治療骨折的蛋白互作網絡，導出.tsv格式文件。將文件導入Cytoscape 3.8.2(https://cytoscape.org/)軟件，通過計算網絡degree以及betweenness參數，分別選取前5位基因，獲取交集得到網絡關鍵基因[22-23]。

1.5 分子對接

將續斷治療骨折的關鍵基因作為受體，續斷中OB前3位有效成分作為配體。通過PDB(http://www.rcsb.org/)數據庫查詢得到續斷治療骨折的關鍵基因分子結構，導出.pdb格式文件[24]。通過TCMSP數據庫導出續斷中OB前3位的有效成分分子結構，導出為.mol2格式文件。將受體分子結構即關鍵基因分子結構導入Pymol(https://pymol.org/2/)軟件，去除水分子和配體結構，得到受體結構[25]。將受體與配體結構導入Autodock 4.2(http://autodock.scripps.edu/downloads)軟件進行分子對接并分析得到最低結合能。同時導出.pdbqt格式文件。將文件導入Pymol軟件，顯示受體與配體結合氫鍵、結合位點以及確定定活性口袋，并將結果可視化。

2 結果

2.1 續斷有效成分以及作用靶點

通過設定OB≥30%和DL≥0.18，得到續斷有效成分為8個(表1)，通過TCMSP數據庫得到作用靶點63個，刪除重復靶點，最終得到作用靶點53個。

表1 續斷有效成分

2.2 續斷治療骨折的作用基因靶點篩選

通過TTD、OMIM、GeneCards、DrugBank、PharmGkb等數據庫查詢骨折相關作用靶點，共得到5 115個相關靶點(圖1)。其中TTD與OMIM數據庫未查詢到與骨折相關靶點。將骨折相關靶點與續斷的作用靶點進行匹配，獲取交集得到34個續斷治療骨折的作用基因靶點(圖2)。

圖1 各數據庫骨折相關作用基因靶點

圖2 續斷作用靶點與骨折相關基因靶點交集

2.3 續斷治療骨折的作用基因靶點GO以及KEGG富集分析

通過DAVID數據庫，設定參與的效應P值小于0.05，參與的基因至少2個。分析得到續斷治療骨折的作用基因靶點參與的生物學過程有76個，其中前10位為：藥物反應、缺乏配體的外部凋亡信號通路、對脂多糖的反應、晝夜節律、對有毒物質的反應、對雌二醇的反應、gamma-氨基丁酸信號通路、線粒體釋放細胞色素c、對輻射的反應以及行為恐懼反應等。參與的細胞成分有20個，其中前10位為：胞質、GABA-A受體復合物、突觸后、神經元投射、等離子體膜、線粒體外膜、氯離子通道復合體、膜筏、線粒體以及pore復合體等。參與的分子功能有20個，其中前10位為：蛋白質同源二聚化活性、GABA-A受體活性、細胞外配體門控離子通道活性、泛素蛋白連接酶結合、相同蛋白的結合、酶結合、前列腺素-內過氧化物合酶活性、BH3域結合、GABA門控氯離子通道活性以及芳香酯活性等，詳見表2。

表2 續斷治療骨折的作用基因靶點GO富集分析結果

KEGG富集分析顯示，治療骨折的作用基因靶點參與的信號通路有44個，其中前10位為：癌癥相關信號通路、結直腸癌相關信號通路、激活神經的受體配體結合相關信號通路、嗎啡成癮相關信號通路、雌激素信號通路、內源性大麻素逆行信號通路、脂肪細胞中脂肪分解調節相關信號通路、細胞凋亡信號通路、神經營養蛋白信號通路、乙型肝炎信號通路等，詳見表3。

表3 續斷治療骨折的作用基因靶點KEGG富集分析結果

2.4 續斷治療骨折的蛋白互作網絡以及關鍵基因

通過STRING數據庫，設定相互作用最低值為0.4，構建續斷治療骨折的蛋白互作網絡，共納入34個基因，79個連接。平均degree參數為4.65，蛋白互作網絡富集P值小于1.0e-16(圖3)。導入Cytoscape軟件，計算degree以及betweenness參數，degree參數前5位基因為：JUN、PTGS2、HSP90AA1、MAPK14、CASP8。betweenness參數前5位基因為：OPRM1、MAPK14、PTGS2、HSP90AA1、PGR。獲取交集得到續斷治療骨折的關鍵基因為PTGS2、HSP90AA1、MAPK14(圖4，圖中黃色為關鍵基因)。

圖3 續斷治療骨折的蛋白互作網絡

圖4 續斷治療骨折的關鍵基因

2.5 分子對接

將續斷治療骨折的關鍵基因：PTGS2、HSP90AA1、MAPK14作為受體，將續斷中OB前3位的有效成分：Gentisin、Sylvestroside Ⅲ_qt、(E，E)-3，5-Di-O-caffeoylquinic acid等作為配體。通過Pymol、Autodock等開源軟件進行分子對接，結果顯示，各小分子均能與配體進行結合。選取結合能最低值的結合位置進行分析，測量結合氫鍵距離以及結合位點(表4、圖5、圖6)。

圖5 各配體受體結合位點

圖6 各配體受體結合區域

表4 各配體受體最低結合能

3 討論

續斷是我國的傳統中藥，因為具有“續折接骨”的作用而得名，但其促進骨折愈合的機制不清，最早在《神農本草經》上出現。歷代本草典籍中以續斷為正名，別名較多，如“屬折”、“接骨”、“續斷藤”、“接骨木”、“馬薊”、“大薊”等。根據續斷的產地別名又有區別，如貴州、云南稱之為“山蘿卜”，四川為“川蘿卜根”，湖北為“黑老鴉頭”、“小續斷”等[10]。

歷代本草典籍中關于續斷的記載又略有不同，其中有些可能是將其他植物誤以為是續斷。清代《植物名實圖考》中對續斷進行了詳細描述，并進行繪圖。并指出之前典籍存在錯誤，如書中記載“此藥習用，并非珍品，不識前人何以未能的識”[10]。表明從清代開始，川續斷成為續斷的唯一正品來源。

本研究通過網絡藥理學以及分子對接技術對其作用機制進行探討。利用在線數據庫TCMSP進行檢索，按照OB和DL這兩個反映藥物被吸收利用程度的指標進行篩選，發現續斷有效成分共有8個，分別為Gentisin、Sylvestroside Ⅲ_qt、(E，E)-3，5-Di-O-caffeoylquinic acid、Sylvestroside Ⅲ、Japonine、Cauloside A_qt、beta-sitosterol、sitosterol。目前尚無這些化合物調控骨折愈合的研究報道。為此，筆者通過TCMSP數據庫繼續檢索，刪除重復作用基因靶點，最終得到上述8種化合物的作用基因靶點53個。將這些作用靶點與骨折愈合相關的基因進行交集分析，發現有34個可能的作用靶點，這些基因為分析續斷促進骨折愈合的機制提供了基礎。

對基因進行富集分析，發現蛋白質同源二聚化活性、GABA-A受體活性、細胞外配體門控離子通道活性、泛素蛋白連接酶結合、相同蛋白的結合、酶結合、前列腺素-內過氧化物合酶活性、BH3域結合、GABA門控氯離子通道活性以及芳香酯活性等這些分子功能可能是續斷調控骨折愈合的重要機制。這些受體以及酶活性是骨折愈合的基礎，但是具體調控機制有待進一步研究。

通過STRING數據庫構建續斷治療骨折的蛋白互作網絡，篩選得到續斷治療骨折的關鍵基因為PTGS2、HSP90AA1、MAPK14。Kong等[26]分析微重力刺激內皮祖細胞調控骨折愈合的機制，發現微重力促進血管形成可能與MAPK信號通路有關。筆者之前的研究也發現MAPK14基因可能與骨折愈合過程中血管形成有關[1]。激活腺苷受體A2A會上調激活骨折組織內血管內皮細胞MAPK14表達。Camal Ruggieri等[27]總結與骨折愈合相關的信號通路，提出MAPK信號通路激活是機械傳導促進骨修復的基礎。超聲波促進成骨細胞增殖、分化以及骨修復可能與上調MAPK有關。Sharma等[28]分析神經纖維瘤蛋白缺陷小鼠，發現MAPK信號通路過度激活可能是小鼠脛骨骨折不愈合的關鍵。所以MAPK通路調控骨折愈合的機制復雜，過度激活或者抑制激活可能均會導致骨折不愈合。目前關于PTGS2與骨折愈合的研究較少。陳建泉等[29]通過網絡藥理學探討女貞子治療骨質疏松性骨折的機制，發現PTGS2是參與促進骨折愈合的主要信號通路。現尚未查到有關于HSP90AA1與骨折愈合的報道。

通過分子對接技術，筆者發現續斷中OB前3位的有效成分Gentisin、Sylvestroside Ⅲ_qt、(E，E)-3，5-Di-O-caffeoylquinic acid均可以與關鍵調控基因結合，且最低生物結合能均小于0，表明結合穩定，無需催化劑參與反應，且大部分結合為3個氫鍵，結合牢固。

本研究在國內外首次采用網絡藥理學以及分子對接技術分析續斷促進骨折愈合的機制，提出其中關鍵基因靶點以及調控的可能機制。不足之處為采用在線數據庫進行分析，需要進一步采用實驗加以證實。而且數據庫數據實時更新，續斷有效成分的作用靶點可能會存在變化。

續斷是促進骨折愈合的傳統中藥，其有效成分有Gentisin、Sylvestroside Ⅲ_qt、(E，E)-3，5-Di-O-caffeoylquinic acid等，促進骨折修復的關鍵作用靶點為PTGS2、HSP90AA1、MAPK14，且有效成分與關鍵作用靶點均可以穩定結合。