補骨顆粒含藥血清對體外成管實驗影響的研究＊

余光書 林焱斌 莊福毅 吳春玲

血管在骨組織的修復(fù)過程起著重要作用，如果新血管形成不足可能會造成氧氣和營養(yǎng)供應(yīng)不足，從而導(dǎo)致骨組織修復(fù)的失敗[1]。新血管的再生多為內(nèi)皮祖細胞（EPCs）分化為內(nèi)皮細胞后再逐漸形成血管的過程，并且EPCs可以通過分泌多種細胞因子或生物活性物質(zhì)參與這個過程[2-3]。因此，通過激活EPCs的活性及通過調(diào)控相關(guān)細胞因子分泌對于骨組織的修復(fù)具有重要意義。本研究結(jié)合既往使用補腎活血中藥“補骨顆粒”對骨組織損傷修復(fù)的良好效果，擬應(yīng)用補骨顆粒含藥血清干預(yù)EPCs，通過體外觀察成管實驗及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達，以期為進一步研究補骨顆粒對骨組織損傷修復(fù)的機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 含藥血清的制備

補骨顆粒中藥組成：骨碎補20 g，鹿銜草12 g，淫羊藿12 g，潞黨參15 g，茯苓20 g，三七3 g，川牛膝9g，當歸9 g，川芎6 g，女貞子15 g，枸杞9 g，生地黃15 g，甘草3 g。補骨顆粒劑由廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院藥劑科負責(zé)加工制備，每克顆粒藥含原生藥9.8 g，使用時用生理鹽水加熱溶解。

將成年SD大鼠（購于中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，編號：430727201101351783）按照隨機對照表分為空白對照組（10只）和實驗組（10只），依據(jù)臨床常用量按實驗動物與人體表面積折算的等效劑量比值換算，將補骨顆粒用生理鹽水加熱溶解，制成1 g/ml的水溶液。空白對照組予生理鹽水2 ml/kg灌胃，實驗組予3.08 g/kg灌胃，1次/d，連續(xù)14 d，末次給藥后2 h處死大鼠，并在無菌條件下采腹主動脈血5 ml，靜置2 h，低溫1 000 g離心15 min后分離血清，于56 ℃恒溫水浴滅活30 min，-80 ℃冰箱保存。

1.2 骨髓EPCs分離及培養(yǎng)

取10周齡的雄性SD大鼠（購于中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，編號：1107272011004991），經(jīng)3%戊巴比妥鈉（上海上藥新亞藥業(yè)有限公司；國藥準字H31021724；規(guī)格：1 ml∶100 g）腹腔注射麻醉成功后分離出大鼠四肢，剔除周圍肌肉組織，然后在無菌平皿中剪開股骨兩端，使用10%胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培養(yǎng)基（SIGMA；貨號：D5796-500ML）反復(fù)沖洗髓腔，將所得的細胞懸液過200目細胞濾網(wǎng)，400g離心5 min收集細胞。然后緩慢加入到Percoll分離液的離心管中以500g離心30 min，吸取中間乳白色云霧狀有核細胞層，PBS沖洗3次后以400g離心10 min，將所得細胞用10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基重懸，反復(fù)吹打制成單細胞懸液后接種于中號培養(yǎng)瓶，置于37 ℃含5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后收集未貼壁細胞，換用EBM-2培養(yǎng)基接種于纖維粘連蛋白（FN）包被的培養(yǎng)皿中，于37 ℃含5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后首次換液，以后每3天換液1次。細胞密度達到70%～80%融合后用含質(zhì)量百分比為0.125%胰酶及0.05%乙二胺四乙酸的消化液進行消化，按1∶4傳代培養(yǎng)。

1.3 流式細胞學(xué)鑒定細胞表面抗原

將上述細胞傳代培養(yǎng)至14 d時，用0.25%胰酶消化細胞，制備細胞懸液，350g離心5 min，收集細胞，0.5%BSA-PBS洗細胞2次。應(yīng)用100 μl 0.5%的BSA-PBS重懸細胞沉淀，然后各管分別加入2 μl CD34-FITC抗體（Bioss；貨號：bs-0646RFITC）、1 μl CD133-FITC抗體（Bioss；貨號：bs-0395r-FITC）和1 μl VEGFR2-FITC抗體（Bioss；貨號：bs-0565r-FITC），同時設(shè)置不染抗體管，37 ℃避光孵育30 min；應(yīng)用0.5%的BSA-PBS洗細胞2次，350g離心5 min，再應(yīng)用350 μl 0.5%的BSA-PBS重懸細胞，然后應(yīng)用流式細胞儀（Beckman；型號：A00-1-1102）檢測，使用cellquest pro軟件進行分析檢測。

1.4 補骨顆粒含藥血清及空白血清對成管實驗的影響

收集上述傳代培養(yǎng)3代的EPCs，加入完全培養(yǎng)基，分別制備密度為2.0×104個/ml的細胞懸液，并按2 ml/孔的原則接種于48孔板中，將其置于37 ℃含5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待每孔細胞匯合度達到50%～60%時，吸棄孔中原培養(yǎng)基并重新加入等體積的空白血清或補骨顆粒含藥血清干預(yù)24 h。分別收集上述細胞用0.25%胰酶[含0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）]將細胞消化下來，制成細胞懸液，用細胞計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細胞密度，用培養(yǎng)基制成4×104個/孔的細胞懸液，然后加入48孔板中（每孔加入100 μl基質(zhì)膠至均勻鋪滿孔）。于37 ℃孵育72 h時拍照觀察成血管情況。

1.5 Elisa方法檢測VEGF

在上述傳代培養(yǎng)3代的EPCs完全培養(yǎng)基，分為空白血清組（n=5）及補骨顆粒含藥血清組（n=5），加入等體積空白血清及補骨顆粒含藥血清進行干預(yù)，分別于24、48及72 h時收集上述干預(yù)后的EPCs培養(yǎng)液作為檢測樣本。然后設(shè)空白孔、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl，然后再加待測樣品10 μl。每孔加入酶標試劑100 μl，空白孔除外。用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min。將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。每孔先加入顯色劑A 50 μl，再加入顯色劑B 50 μl，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μl以終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

將Elisa方法檢測的VEGF數(shù)值采用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。兩組同一時間點的對比采用配對樣本t檢驗；同一指標組間兩兩比較采用單因素方差分析，當方差齊性時應(yīng)用LSD方法檢驗，當方差不齊時應(yīng)用Tamhane’sT2進行統(tǒng)計檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細胞表型分析

將細胞傳代培養(yǎng)至14 d時收集細胞，使用流式細胞檢測儀檢測提示CD34+細胞比例為70.03%，CD133+細胞比例為67.99%，血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2（VEGFR2+）細胞比例為63.96%。

2.2 空白血清組與補骨顆粒含藥血清組體外基質(zhì)膠血管生成實驗結(jié)果對比

空白血清組與補骨顆粒含藥血清組細胞在半固體培養(yǎng)基中于24 h內(nèi)呈索狀生長，補骨顆粒含藥血清組于72 h后細胞形態(tài)趨于典型，呈毛細血管腔樣結(jié)構(gòu)；而空白血清組未形成典型的毛細血管腔樣結(jié)構(gòu)，見圖1。

2.3 空白血清組與補骨顆粒含藥血清組VEGF表達量對比

補骨顆粒含藥血清組在干預(yù)24 h時的VEGF表達量明顯高于空白血清組（t=3.069，P=0.037），在干預(yù)48 h時的VEGF表達量也明顯高于空白血清組（t=2.939，P=0.042）；但在干預(yù)72 h時補骨顆粒含藥血清組與空白血清組VEGF表達量對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.541，P=0.064）。補骨顆粒含藥血清組在干預(yù)24、48、72 h時的VEGF表達量對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.684，P=0.523），而空白血清組在干預(yù)24、48、72 h時的VEGF表達量明顯升高（F=5.656，P=0.019），見表 1。

表1 空白血清組與補骨顆粒含藥血清組VEGF表達量對比

3 討論

血管新生是機體從已有的毛細血管網(wǎng)基礎(chǔ)上，通過內(nèi)皮細胞增殖、遷移和出芽方式形成新的毛細血管的過程，對于組織的修復(fù)起重要作用。由于EPCs具備自我更新和分化能力，在一定條件下可誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細胞，所以近年通過研究EPCs在不同條件下對血管新生影響的研究也越來越多[4]。另外，自從研究者們發(fā)現(xiàn)血管EPCs在體外合適的培養(yǎng)條件下具有形成毛細血管樣結(jié)構(gòu)的能力，因此EPCs體外成血管實驗由此被廣泛應(yīng)用于血管新生的研究[5]。本研究在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用補骨顆粒含藥血清對EPCs進行干預(yù)，通過成血管實驗也發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞具有形成毛細血管樣結(jié)構(gòu)的能力，并且這種能力在一定條件下受到補骨顆粒含藥血清的促進作用。

EPCs是內(nèi)皮細胞的前體細胞，其主要存在于臍帶血、外周血及骨髓等，而骨髓內(nèi)的EPCs在內(nèi)源性或外源性刺激因素作用下分化為內(nèi)皮細胞是參與血管新生的主要方式。本研究發(fā)現(xiàn)EPCs能夠分化為內(nèi)皮細胞且參與血管新生，這與目前研究發(fā)現(xiàn)EPCs能夠促進血管網(wǎng)的形成從而促進骨組織的形成一致[6]。但是，目前對于其促進血管新生的方式仍存在一定的爭議。比如有研究認為EPCs主要通過直接分化為內(nèi)皮細胞而參與血管新生，也有研究認為其主要通過細胞因子影響血管的新生[7]。而機體中的血管新生受全身性和局部產(chǎn)生的信號的影響，本研究沒有進一步從體內(nèi)分開研究細胞因子對局部血管新生的影響，這對于討論EPCs促進血管新生的機制存在一定的不足，今后可進一步從EPCs對體內(nèi)血管新生的影響及局部細胞因子干預(yù)后血管新生情況進行研究。

VEGF是一種分子量在3 445 kDa的分泌性二聚體糖蛋白，對內(nèi)皮細胞具有促進分裂和抗凋亡作用，還可增加血管通透性，促進細胞遷移，對血管生成過程中起積極作用，對EPCs的生長也存在重要作用[8]。而VEGF的生物學(xué)效應(yīng)主要通過與VEGFR結(jié)合，從而激活細胞膜激酶級聯(lián)反應(yīng)信號并將其傳遞到細胞核，引起細胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達的改變而影響血管通透性，并最終形成新生血管[9]。目前，大量文獻已報道了通過持續(xù)提供VEGF或保持較高濃度的VEGF，將會促進血管的新生及骨組織的增生[10-11]。但是，VEGF的半衰期較短，容易在機體內(nèi)擴散水解，從而導(dǎo)致單位體積內(nèi)的VEGF濃度降低而影響其生物學(xué)效應(yīng)[12]。因此，通過基因技術(shù)或外源性刺激因素提高VEGF表達量將是目前研究的重點[9，13]。本研究結(jié)合既往補骨顆粒對骨組織損傷修復(fù)具有良好效果的基礎(chǔ)上，通過應(yīng)用補骨顆粒含藥血清干預(yù)EPCs后也發(fā)現(xiàn)其對VEGF表達具有一定影響，這對進一步了解補骨顆粒對骨組織的修復(fù)影響具有重要意義。由于本研究并未進一步探討補骨顆粒對VEGF表達影響的具體機制，這對于研究存在一定的不足。但是，補骨顆粒主要由補腎活血中藥組成，既往研究發(fā)現(xiàn)其具有改善局部氧含量及激活細胞活性的作用[14]。因此今后可以從補骨顆粒對氧濃度及缺氧誘導(dǎo)因子-α（HIF-α）信號途徑的影響來探討VEGF表達的動力學(xué)機制。

本研究通過應(yīng)用補骨顆粒含藥血清干預(yù)EPCs后發(fā)現(xiàn)補骨顆粒含藥血清可以激活EPCs的活性，促進VEGF表達，從而增強EPCs的血管生成作用，這為進一步研究補骨顆粒對骨組織損傷修復(fù)的機制提供有效理論依據(jù)。