蘇云金芽孢桿菌IX-01胞外多糖的體外益生特性

高澤鑫，孫武，胥聆銘，張蕾蕾，朱莉，詹曉北

(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

細菌胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)是由細菌在發酵中產生的胞外多糖，可以低成本大量生產。大多數細菌EPS是高分子質量多糖，通常由多個重復的糖單元組成，這些多糖在食品工業中廣泛用作懸浮劑，增稠劑和穩定劑等[1]。EPS是生物膜的重要組成部分，具有多樣化的結構特征和生物活性，因此受到了廣泛的關注[2-3]。目前，在許多種革蘭氏陽性和革蘭氏陰性的細菌中都發現了EPS的產生[4]。

芽孢桿菌是一個重要的細菌屬，具有耐酸、耐堿、耐高溫高壓和貯存時間長等特點[5]。目前，有關EPS應用的芽孢桿菌包括解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等。此外，蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)產生的伴胞晶體蛋白可以有效殺死多種害蟲，但對人、畜類、禽類和水生動物無毒，因此廣泛應用于生物農藥的開發[6]。然而，對B.thuringiensis產的EPS研究卻很少。

大分子的多糖在胃和小腸中不易消化，但可被腸道微生物部分或完全水解[7]。多糖能滋養和調節多種腸道微生物種群，誘導其多樣性和豐度的變化[8]。研究表明，腸道微生物對人類健康起著重要作用，包括維持腸道屏障的完整性、調節宿主免疫力、抑制腸道病原體和促進維生素的合成[9]。因此，保持腸道微生物的多樣性和保護微生態平衡對調節宿主健康至關重要。腸道微生物可以將多糖發酵形成短鏈脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)，主要成分是乙酸、丙酸和丁酸，它們在代謝方面具有重要的作用[10]。乙酸是結腸上皮細胞的能量來源，并能調節免疫細胞的活性[11]。丙酸在肝臟中的脂肪酸代謝和增強胰島素敏感性方面具有關鍵作用[12]。而丁酸可以通過調節蛋白質來改善腸道屏障功能的完整性[13]。

本文介紹了從郫縣豆瓣中分離出的B.thuringiensisIX-01采用高密度發酵法生產EPS，對提純后的BPS-2進行體外細胞毒性分析，在確認其無細胞毒性的基礎上通過10個健康人混合糞便微生物的體外靜態發酵探究了其EPS的益生功能。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌種：從中國成都市郫都區市售豆瓣中分離出1株富含EPS的菌株，通過生理生化和16S rRNA分析，鑒定為B.thuringiensis被命名為IX-01，菌株已保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC M 2020486)，16S rRNA基因序列被保存在GenBank(NCBI)中，登錄號為OL687443。

人正常結腸上皮細胞(HcoEpiC)從中國科學院上海分院獲得。

單糖標準品，Sigma公司；DEAE-Sepharose Fast Flow，索萊寶科技有限公司；Superdex 200，GE Healthcare公司；DMEM培養基，海克隆生物化學制品有限公司；其他試劑均為國產分析純。

B.thuringiensisIX-01的種子培養基(g/L)：葡萄糖 1.0，胰蛋白胨 1.0，K2HPO40.025，KH2PO40.05，NaCl 0.5，pH 6.5。

B.thuringiensisIX-01的發酵培養基(g/L)：葡萄糖 111.24，大豆蛋白胨 9.64，BaSO40.24，K2HPO40.025，KH2PO40.05，NaCl 0.5。

腸道厭氧基礎營養培養基(g/L)：蛋白胨 2.0，酵母提取物 2.0，NaHCO32.0，NaCl 0.1，KH2PO40.04，K2HPO40.04，L-半胱氨酸鹽酸鹽 0.5，牛膽鹽 0.5，CaCl20.01，MgSO40.01，血紅素 0.025，刃天青0.001，維生素K 0.002，吐溫80 2。

1.2 儀器與設備

Bio Flo 115發酵罐，美國New Brunswick Scientific公司；HYQX-Ⅱ厭氧培養箱，上海躍進醫療器械有限公司；Waters 600高效液相色譜儀，美國Waters公司；ICS5000離子色譜儀，美國戴安公司；7890A氣相色譜儀，美國Agilent公司；IX53倒置生物顯微鏡，日本奧林巴斯公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 EPS的生產

將IX-01的單個菌落接種到含有100 mL種子培養基的500 mL錐形瓶中，在200 r/min和37 ℃下培養12 h，種子培養物接種于7-L發酵罐中。初始發酵培養基體積為4 L，種子接種量為10%(體積分數)。在發酵過程中，溫度保持在30 ℃，通過添加2.0 mol/L氨水使pH值保持在6.5。發酵開始前加入111.24 g葡萄糖，在發酵后的3 h內不添加葡萄糖。通過生物傳感分析儀監測葡萄糖濃度，并調整相應的葡萄糖進料速度。整個發酵過程共分為3個階段：0～18 h，攪拌速度250 r/min，通氣量為3 L/min；18～56 h，攪拌速度300 r/min，通氣量為4 L/min；56～72 h，攪拌速度350 r/min，通氣量為5 L/min。

1.3.2 EPS的提取

將發酵液11 000 ×g離心20 min，取上清液。先加入5 g/L胰蛋白酶和5 g/L胃蛋白酶在37 ℃下100 r/min反應4 h，再加入5 g/L木瓜蛋白酶在 60 ℃下100 r/min反應2 h。后加入Savage試劑[V(氯仿)∶V(正丁醇) = 4∶1]以體積比3∶1 混勻振蕩20 min，以5 000 r/min離心10 min收集上清液，將上清液用此方法重復8次，得到去除蛋白質的上清液。再把上清液與4倍體積的無水乙醇混合，在4 ℃下放置24 h。收集沉淀并溶解在去離子水中，得到粗EPS溶液，在去離子水中透析72 h，凍干。將粗制的EPS(0.5 g)重新溶解在5 mL的去離子水中，注入DEAE-Sepharose快速流動柱(1.6 cm × 50 cm)，用去離子水洗脫，然后用NaCl溶液(0.1～1 mol/L)進行洗脫，流速為60 mL/h，收集餾分通過蒽酮-硫酸法測量糖含量。最后，將主要的碳水化合物組分通過Superdex 200柱(3.5 cm×100 cm)純化，使用去離子水進行洗脫，流速為20 mL/h，得到一種EPS，命名為BPS-2。

1.3.3 BPS-2組成分析

用蒽酮-硫酸法和Bradford法分別測定了BPS-2的總糖和總蛋白含量[14-15]。采用高效凝膠滲透色譜法進行測量多糖的分子質量，通過Waters 600高效液相色譜儀，該儀器配有2410示差折光檢測器和Empower 工作站，Ultrahydrogel Linear(300 mm×7.8 mm)凝膠柱，柱溫保持在45.0 ℃，流速維持在0.95 mL/min，使用0.1 mol/L NaNO3作為流動相，樣品制備為3 mg/mL的溶液。單糖組成測定的具體方法為：取5 mg BPS-2在安培瓶中加入300 μL的三氟乙酸(2 mol/L)在110 ℃中水解10 h。然后，通過氮氣除去三氟乙酸，將殘余物用甲醇溶解，通過氮氣干燥，重復以上操作3次。最后，將殘留物溶解在去離子水中，并使用0.22 μm膜過濾后進行分析。通過CarboPac PA20色譜柱在Dionex離子色譜系統(ICS 5000)中檢測水解產物和1 g/L單糖標準品(葡萄糖，半乳糖，氨基葡萄糖，巖藻糖，果糖，木糖，甘露糖，鼠李糖和阿拉伯糖)的保留時間和峰面積，最終獲得BPS-2的單糖組成及其含量。

1.3.4 細胞毒性分析

HcoEpiC細胞維持在DMEM培養基中，在孵化器中補充10%(體積分數)胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，青霉素(100 μg/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)，并在37 ℃下，5%CO2的潮濕環境中孵育。通過四唑鹽(MTT)法體外評估BPS-2對HcoEpiC細胞的毒性。HcoEpiC細胞經過0.25%(質量分數)胰蛋白酶消化后調整細胞濃度到3×104細胞/孔，在裝有0.1 mL培養基的96孔板中于37 ℃，5%CO2的潮濕環境中孵育。使HcoEpiC細胞黏附24 h，形成部分單層。然后甩出上清液，并用100 μL培養基洗滌單層。用培養基分別制備100 μL不同質量濃度(100、75、50、25 μg/mL)的BPS-2溶液，并將其添加到各個孔中。每24 h進行顯微鏡檢查并記錄觀察結果。培養48 h后，除去含BPS-2溶液的培養基。然后將附著的細胞在含有10 μL MTT溶液的培養基中孵育3 h。除去培養基后，加入200 μL的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，于搖床室溫振蕩10 min。用Thermo酶標儀測定490 nm處的吸光度。

1.3.5 利用人糞便微生物菌群體外發酵BPS-2

用無菌糞便收集管采集10名健康的志愿者(5男5女，年齡25～30歲)的糞便。將這10份新鮮糞便在厭氧環境下等量混合后，用無菌PBS稀釋，得到糞便勻漿10 g/mL。在無菌條件下通過4層紗布過濾去除殘渣，將糞便勻漿接種到不同組的腸道厭氧基礎營養培養基中。陰性對照組為腸道厭氧基礎營養培養基(無碳源)，實驗組分別以菊粉(陽性對照)和BPS-2為碳源添加到腸道厭氧基礎營養培養基中，質量濃度均為5 g/mL。37 ℃孵育48 h。在發酵0、24、48 h分別采集樣品進一步分析。

將250 μL HCl溶液和1 mL的無水乙醚添加到1 mL 發酵上層清液液，向體系中加入0.1 mL 2-乙基丁酸內標溶液(0.1 mg/mL)后劇烈搖動溶液5 min來制備樣品溶液。取上層有機相用無水硫酸鈉脫水，收集上清液，通過0.22 μm微孔濾膜過濾。采用HP-INNOWAX柱的氣相色譜儀分析SCFAs。進樣器參數設置：烘箱溫度為60 ℃，在4 min內升至190 ℃。注入器溫度設置為220 ℃，檢測器溫度設置為250 ℃。每個樣品5 μL，流速1.5 mL/min，分流比1∶20。根據每個SCFA與內標的峰面積比繪制校準曲線。根據標定曲線，根據峰面積比計算樣品中SCFAs的濃度。

1.3.7 16S rRNA基因測序

采用QIAamp DNA Stool Mini Kit提取細菌基因組DNA。采用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴增16S rRNA基因的V3～V4區。通過TruSeq-DNA PCR-Free樣品制備試劑盒生成測序文庫，并用MiSeq PE250平臺進行焦磷酸測序。分別使用FLASH(v1.2.7)和Qiime(v1.9.1)進行配對末端讀段的組裝和質量控制。利用Uparse算法(Uparse v7.0.1001)對所有樣本的全部 Effective Tags進行聚類，默認以97%的一致性(identity)將序列聚類成為操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)，同時會選取OTUs的代表性序列，依據其算法原則，篩選的是OTUs中出現頻數最高的序列作為OTUs的代表序列。對OTUs序列進行物種注釋，用Mothur方法與SILVA138(http://www.arb-silva.de/)的SSUrRNA數據庫進行物種注釋分析，獲得分類學信息并分別在門水平、屬水平上統計各樣本的群落組成。所有的原始序列都存放在NCBI中，序列號為SAMN23526837-SAMN23526848。

1.3.8 α多樣性分析與β多樣性分析

使用Qiime軟件(v1.9.1)計算Chao1，Shannon，Simpson和ACE指數，使用R軟件(v2.15.3)進行α多樣性指數組間差異分析，檢測方法選用Tukey檢驗。

用Qiime軟件(v1.9.1)計算Unifrac距離，使用R軟件(v2.15.3)進行β多樣性指數組間差異分析，使用R軟件繪制主成分分析(principal component analysis，PCA)圖。PCA使用R軟件的ade4包和ggplot2軟件包，檢測方法選用Tukey檢驗。

1.4 數據分析

實驗均進行3次生物學重復，結果表示為平均值±標準偏差。使用Origin 2018軟件作圖，采用SPSS 19.0軟件進行Tukey′s test，P<0.05表示統計學分析中差異顯著。

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2 結果與分析

2.1 7-L發酵罐分批發酵

通過7-L發酵罐對B.thuringiensisIX-01進行分批發酵，探究了菌種在高密度環境下對EPS生產的影響。眾所周知，碳源的加入與EPS產量有很大的關系，為了提高葡萄糖的利用率，在EPS的生產中采用了碳饑渴的調控機制。在發酵到17～21 h時，通過線下監控維持發酵罐中葡萄糖含量在1 g/L以下，此時EPS產量迅速降低，在發酵進行到26 h時，細胞干重(dry cell weight,DCW)達到峰值并在之后的發酵過程中維持在23～26 g/L(圖1-A)。結果表明，在細胞濃度處于一個高水平時，會大量消耗周圍的一切養分，從而導致了EPS含量降低。因此，通過控制碳源的補加策略在提高細胞濃度的同時降低了細胞整體的碳饑渴程度。

該策略不僅使B.thuringiensisIX-01能達到高密度發酵要求，而且為產生更多EPS創造了有利條件。當碳饑渴時間為4 h，發酵72 h時，IX-01的EPS產量達到最大(16.19±0.55)g/L，同時該組的葡萄糖調控結果是所有試驗組中的最佳值(圖1-B)。

A-維持碳饑餓4 h的情況下的發酵結果；B-不同的碳饑餓 時間對EPS生產的影響圖1 7-L發酵罐水平、葡萄糖調控對EPS生產的影響Fig.1 The influence of 7-L fermenter level, glucose regulation on EPS production.

2.2 EPS的分離純化與成分分析

粗制的EPS經DEAE-Sepharose快速流動柱純化，用純水和不同濃度NaCl洗脫。如圖2-A所示，EPS關鍵組分在NaCl緩慢增加到0.2 mol/L時被洗脫下來。收集的EPS關鍵組分再通過Superdex 200色譜柱用水進行洗脫，洗脫曲線見圖2-B，洗脫后得到1個吸光度值最大的組分，命名為BPS-2。

A-DEAE-Sepharose快速流動柱的洗脫曲線；B-Superdex 200 色譜柱的洗脫曲線圖2 BPS-2的純化洗脫曲線Fig.2 Purification elution curves of BPS-2

根據蒽酮-硫酸法和考馬斯亮藍法測得的BPS-2總糖和蛋白含量分別為(91.29±3.71)%、(1.31±0.27)%(質量分數)。分子質量與單糖組成結果表明，BPS-2的分子質量為27.96 kDa，主要由氨基半乳糖、阿拉伯糖、氨基葡萄糖、葡萄糖和甘露糖組成，摩爾百分比為5.53∶1.77∶4.74∶3.24∶1。

RAMAMOORTHY等[16]從海洋中篩選得到一株B.thuringiensisRSK CAS4，通過搖瓶發酵后提取得到的EPS由果糖(43.8%)，半乳糖(20%)，木糖(17.8%)，葡萄糖(7.2%)，鼠李糖(7.1%)和甘露糖(4.1%)組成。WANG等[17]選用一株B.thuringiensis4D19通過搖瓶發酵后提取得到了一種EPS，其單糖組成是甘露糖(44.2%)、氨基葡萄糖(35.5%)、氨基半乳糖(8.0%)、葡萄糖(5.5%)、阿拉伯糖(5.1%)、半乳糖(0.9%)、甘露糖醛酸(0.3%)和葡萄糖醛酸(0.2%)。本研究得到的BPS-2分子質量和單糖組成與以往報道均不同，表現出其EPS的特異性，其中氨基糖(氨基葡萄糖與氨基半乳糖)的占比達到63.1%。這可能是由于B.thuringiensisIX-01在高密度發酵過程中通過氨水調控pH誘導的。

2.3 BPS-2的細胞毒性分析

微生物EPS與化學合成分子相比幾乎沒有副作用，但關于EPS對多種類型細胞的特異性和非特異性細胞毒性仍需要得到重視。EPS和細胞的生物相容性是評估EPS生物活性的一個重要前提條件。由于B.thuringiensisIX-01是從傳統發酵食品郫縣豆瓣中篩選的，從菌株來源來上分析是安全的。但B.thuringiensis以往的研究報告多用于生物農藥方向，其菌株產EPS的安全性評估的研究極少。

考慮到BPS-2作為一種潛在益生元，我們在研究中選用HcoEpiC細胞通過MTT法進行了體外細胞毒性的測試。如圖3-A所示，隨著BPS-2的反應濃度不斷升高，均未表現出對HcoEpiC細胞的顯著抑制作用，細胞形態均未表現出形變。同時，隨反應時間的增加，也未表現出對HcoEpiC細胞的顯著抑制作用，細胞生存率均在98%以上(圖3-B、圖3-C)。結果表明，B.thuringiensisIX-01產的BPS-2無細胞毒性。

A-BPS-2與HcoEpiC細胞的相互作用(比例尺=100 μm)；B-HcoEpiC細胞的生存能力(24 h)；C-HcoEpiC細胞的生存能力(48 h)圖3 BPS-2與HcoEpiC細胞的毒性分析Fig.3 Toxicity analysis of BPS-2 with HcoEpiC cells.注：相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.4 BPS-2對SCFAs的影響

SCFAs是腸道微生物群的主要代謝產物，參與宿主的各種生理過程，包括保護腸道屏障，調節肝臟中脂質代謝，以及調節激素釋放[18]。本研究中，用健康人的糞便細菌在厭氧管中進行菊粉、BPS-2和空白的體外發酵，在發酵0、24、48 h后測定SCFAs濃度(圖4)。

A-乙酸；B-丙酸；C-丁酸；D-總SCFAs圖4 不同碳源與糞菌發酵后SCFAs濃度的變化Fig.4 Changes in the concentration of SCFAs after fermentation with different carbon sources and fecal bacteria

眾所周知，菊粉是天然的益生元，同時是理想的功能性食品配料，因此本研究選用菊粉作為BPS-2的陽性對照。在發酵48 h時，菊粉和BPS-2產生的總SCFAs濃度分別為(50.12±0.85)、(50.59±1.54) mmol/L(圖4-D)，顯著高于0 h時CK(陰性對照)組中的總SCFAs濃度(P<0.05)，這一結果表明，BPS-2與菊粉均能顯著提高糞菌發酵過程中SCFAs的產量。但在發酵24 h時，菊粉的總SCFAs濃度遠高于BPS-2，造成該情況原因可能是由于BPS-2分子質量遠高于菊粉，腸道微生物在接觸BPS-2初期無法迅速利用。在發酵48 h時，BPS-2產生的乙酸，丙酸和丁酸的含量分別為(31.59±0.73)、(10.82±0.65)、(8.18±0.2) mmol/L(圖4-A～圖4-C)，與CK相比，BPS-2和菊粉組中的乙酸，丙酸和丁酸濃度均顯著增加(P<0.05)。乙酸能夠保持腸道環境的穩定，控制宿主食欲減少脂肪的產生，并有助于滋養腸道中產丁酸的細菌，促進腸道有益菌群的多樣性[9]。在發酵48 h時，BPS-2的丙酸濃度顯著高于CK組(P<0.05)，同時其含量也明顯高于同時間的菊粉。丙酸是SCFAs 的重要組成成分，在宿主體內可以通過調節免疫細胞來達到降低肝臟和血漿中脂肪酸的水平[19]。在發酵48 h時，BPS-2組的丁酸濃度相較于CK組與菊粉組顯著升高(P<0.05)。丁酸是結腸細胞的重要供能物質，起到維護腸道上皮屏障的功能穩定，并通過刺激脂肪酸氧化基因的表達，降低肝臟中的總膽固醇[20]。有研究表明，丁酸在結腸上皮細胞增殖和分化時起到了重要的調節作用，同時丁酸具有誘導腸道癌細胞凋亡的作用[21]。

以上結果表明，BPS-2能促進腸道微生物產生SCFAs，尤其是丙酸和丁酸的產生。

2.5 BPS-2對腸道微生物菌群的影響

現在越來越多的多糖被用于調節腸道微生物群，改善人類的健康。LIU等[22]發現，蘆薈多糖能顯著增強小鼠糞便中SCFAs的產生，主要通過副桿菌屬(Parabacteroides)降解蘆薈多糖，對腸道微生物菌群產生有益的影響。本研究通過16S rRNA檢測腸道微生物菌群的變化。在體外厭氧發酵的情況下，評估了菊粉和BPS-2對糞便微生物菌群組成的影響。

如圖5-A所示，BPS(BPS-2)組的Shannon、Simpson和Chao1指數均顯著高于CK(空白)組(P<0.05)，表明BPS-2發酵相對于CK組而言，明顯提高了物種的多樣性。而PCA圖將CK、菊粉和BPS的發酵分成3個不相近的群組(圖5-B)，表明各組之間的糞便微生物菌群組成存在明顯差異。但腸道微生物在多糖代謝中的作用是復雜的，必須在門和屬的水平上進行更加深入的研究。

糞便微生物組成在門水平上的變化如圖5-C所示，與CK組相比，BPS組和菊粉組的變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度明顯降低。在BPS組的發酵過程中，擬桿菌門(Bacteriodetes)的相對豐度明顯高于菊粉和CK組。大分子多糖是Bacteriodetes的主要能量來源，參與人類結腸的許多重要代謝活動，其中Bacteriodetes產生的多糖降解酶要比厚壁菌門(Firmicutes)多，可水解不可消化的多糖以促進SCFAs的產生[23]。因此，在有BPS-2的情況下，腸道微生物菌群的組成相對于菊粉來說更有利于多糖的分解。

A-腸道微生物群的α多樣性；B-基于加權Unifrac距離的OTU水平的微生物群的PCA；C-門水平的菌群相對豐度； D-屬水平的菌群相對豐度圖5 空白組、菊粉組和BPS-2組分別與糞便細菌發酵期間(48 h)的細菌分類概況Fig.5 Bacterial taxonomic profiles during CK, inulin and BPS-2 fermentations with fecal bacteria at 48 h

而糞便微生物組成在屬水平上的變化如圖5-D所示，與菊粉組相比，BPS組中巨球形菌屬(Megasphaera)、梭桿菌屬(Fusobacterium)和巨單胞菌屬(Megamonas)的相對豐度明顯降低(P<0.05)，而Parabacteroides的相對豐度相比于菊粉組與CK組顯著增加(P<0.05)。據報道，Megamonas是亞洲人群中的一個典型菌屬，但其高豐度與結腸癌的發病率明顯相關[24]。相對于菊粉組，BPS組也顯著降低了Fusobacterium的相對豐度(P<0.05)。Fusobacterium的高豐度對人類來說是不利的，與膽汁代謝異常和腸道炎癥相關[25]。在BPS-2發酵過程中，Parabacteroides成為核心群落。相關研究表明，腸道微生物群中的Parabacteroides可以通過產生乙酸來減少中性粒細胞的浸潤，從而達到減輕乙酰肝素酶對急性胰腺炎的不利影響[26]。

以上結果證實BPS-2可以作為一種潛在的益生元，在豐富有益菌Parabacteroides的同時抑制潛在的有害微生物群，如Megamonas和Fusobacterium。

3 結論

本文研究了B.thuringiensisIX-01產生的BPS-2，并對其作為益生元的特性進行評價。以葡萄糖、大豆蛋白胨為主要原料，采用高密度發酵對IX-01進行擴大培養，通過碳調控機制的優化使EPS的產量達到最大(16.19±0.55) g/L。經過純化后，BPS-2的總糖含量達到91.29%，蛋白質含量為1.31%，其分子質量為27.96 kDa。BPS-2單糖組成為氨基半乳糖、阿拉伯糖、氨基葡萄糖、葡萄糖和甘露糖，摩爾百分比為5.53∶1.77∶4.74∶3.24∶1。用HcoEpiC細胞對BPS-2的細胞毒性進行評價，在確認BPS-2無明顯細胞毒性的基礎上進行體外健康人的糞便菌群發酵，結果表明BPS-2可以顯著增加Parabacteroides的相對豐度，減少有害微生物菌群的豐度，如Megamonas和Fusobacterium，進而參與改善腸道微生物菌群的組成。同時BPS-2在發酵過程中能被糞便菌群有效利用，并顯著增加SCFAs中丙酸與丁酸的產生。綜上，B.thuringiensisIX-01產生的BPS-2具有一定的益生功能。但離真正推廣到食品領域中還有很長距離，接下來應從體內動物實驗入手，為BPS-2在食品中應用提供更加充分數據和理論支持。