高壓熱殺菌結合酸對枯草桿菌芽孢的殺滅作用

章中，楊杰，申瑾，畢可，劉月，辛偉山，張變飛

(寧夏大學 食品與葡萄酒學院，寧夏 銀川，750021)

芽孢通常存在于環境中，包括食品中，它自身獨特的結構使其對熱、干燥、紫外線和γ輻射等處理以及一些殺菌化學物質具有極強的抵抗力[1-2]，很難被殺滅。由于殺菌強度不夠，芽孢引起的食物腐敗和食物中毒時有發生[3-4]。高壓熱殺菌(high-pressure thermal sterilization，HPTS)作為一種新型的食品殺菌技術，可以殺滅食品中所有微生物，包括最難殺死的芽孢[5]，相比于高溫殺菌，HPTS處理過程相對溫和，對食品的感官和營養品質的損害較小[6-7]。

近年來，相關研究致力于HPTS與其他因素相結合來進一步提高芽孢的致死性，例如降低介質的pH，TOLA等[8]報道：隨著介質pH值的降低，HPTS殺滅地衣桿菌芽孢的數量在增加。ROBERTS等[9]發現pH越低，芽孢的抗性減弱，在400 MPa、45 ℃條件下，當pH值從7.0降到4.0時，多殺滅了1.5個對數的凝結桿菌芽孢。然而在高壓熱處理過程中，酸度對芽孢失活的影響以及兩者結合殺滅芽孢的作用機理，目前尚不明確。HPTS主要影響芽孢內膜的通透性、膜脂的流動性[10]和芽孢蛋白質、核酸的結構[11]。研究表明，HPTS破壞了芽孢內膜對水分子的通透屏障，大量水分子進入芽孢內核而導致內核水合和芽孢死亡[12-13]，而不同pH值不僅可以改變蛋白質、核酸等生物大分子的電荷，還可以改變細胞膜的電荷，從而影響微生物的功能和活性[14]。WUYTACK等[15]研究人員發現，低pH值會改變氨基酸側鏈的電離狀態，從而改變電荷分布和蛋白質構象。SETLOW等[16]研究表明酸對芽孢的殺滅涉及芽孢通透性屏障的破壞。

傅里葉變換紅外光譜儀目前廣泛應用于綜合檢測微生物的生理狀態[17]，具有高分辨率、高靈敏度和高效掃描等優勢，利用該儀器對芽孢紅外光譜中不同波段進行研究，可以分析出HPTS與酸共同作用下芽孢膜脂相態和蛋白質、核酸等物質的變化情況。

本文將HPTS與酸處理相結合，對枯草桿菌芽孢進行處理，研究HPTS與酸聯合作用對枯草桿菌芽孢的殺滅效果并探討其殺滅機理，為深入研究芽孢殺菌抗性及HPTS在殺滅細菌芽孢上的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，編號As 1.433；營養瓊脂，天津市大茂化學試劑廠；促芽孢生長錳鹽營養瓊脂培養基，向營養瓊脂中加入MnSO4·H2O(使Mn2+質量濃度為 50 mg/L)，調pH值，滅菌備用；碘化丙啶(propidium iodide，PI)、TSA-YE培養基，北京索萊寶科技有限公司；鹽酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純)，天津市天力化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-9000S型雙光束紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；Scientz-1LS真空冷凍干燥干燥濃縮儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；Spectrum Two型傅里葉變換紅外光譜儀，美國PerkinElmer公司；CyFlow Cube 8流式細胞儀，日本SYSMEX(希森美康)株式會社；5L HPP超高壓設備，包頭科發高壓科技有限公司

1.3 實驗方法

1.3.1 枯草桿菌芽孢懸浮液的制備

將活化的枯草芽孢桿菌(As 1.433)劃線接種到試管斜面促芽孢生長錳鹽營養瓊脂培養基上，37 ℃條件下培養7 d，用無菌去離子水洗滌離心(4 ℃、9 000 r/min、15 min)芽孢3次，芽孢懸浮液濃度大約調整到1.5×109CFU/mL，4 ℃下保存[18]。實驗前將枯草桿菌芽孢懸浮液濃度調整到1.5×107CFU/mL左右。

1.3.2 枯草桿菌芽孢懸浮液的HPTS結合酸處理

通過鹽酸標準液將芽孢懸浮液pH值調整為1、4、7，各取10 mL芽孢懸浮液于無菌聚乙烯塑料袋中，抽真空封口后置于超高壓設備腔體中，處理介質為水，作為壓力和溫度的傳遞介質對芽孢懸浮液加壓升溫。壓力為550 MPa，處理溫度為 25、65、75 ℃，保壓處理20 min，處理時間不包括升壓和卸壓所需時間。壓力水平，時間和溫度由計算機控制。

1.3.3 枯草桿菌芽孢平板計數方法

將處理前后的芽孢懸浮液進行梯度稀釋后，在平板中吸取1 mL稀釋液并倒入15～20 mL TSA-YE培養基混勻，凝固后在 37 ℃下倒置培養24～48 h，計算菌落總數對數值。

1.3.4 枯草桿菌芽孢紫外吸收物質泄漏量的測定

將處理前后的芽孢懸浮液離心(4 ℃、9 000 r/min)15 min，收集上清液，以無菌去離子水為空白參比，使用紫外分光光度計測定260 nm(核酸)和280 nm(蛋白質)處的吸光值。

1.3.5 流式細胞儀檢測枯草芽孢桿菌芽孢內膜通透性

取處理前后的芽孢懸浮液，將菌液濃度稀釋到106～107CFU/mL。使用PI染色，在1 mL芽孢懸浮液中加入0.75 μL 20 mmol/L的PI染色液，在室溫下暗處孵育15 min。用流式細胞儀檢測前向散射光、側向散射光、熒光通道FL2和FL3。采用488 nm激發光，PI標記細胞在615 nm處發紅色熒光(FL3)[19]。數據采集后用FSC Express Version 3.0軟件分析。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜分析

將處理前后的樣品進行冷凍干燥，于瑪瑙研缽中磨粉，再與干燥的KBr粉末混合均勻，壓片后置于傅里葉紅外變換光譜儀上，于4 000～500 cm-1內進行掃描，掃描次數為32次，分辨率為4 cm-1。

1.3.7 統計分析

所有實驗至少重復3次。采用Origin 2018軟件對實驗結果進行分析和作圖，以P<0.05為顯著差異的標準。

2 結果與分析

2.1 HPTS結合不同pH處理對枯草桿菌芽孢殺滅效果的影響

圖1為HPTS結合不同pH處理后枯草桿菌芽孢存活濃度的變化。由圖1可知，枯草桿菌芽孢處理前的初始計數約為1×107CFU/mL。常溫常壓下pH=1、pH=4和pH=7單獨處理后枯草桿菌芽孢的存活濃度分別為6.71、6.77、6.82 lgCFU/mL，與常溫常壓下pH值單獨處理相比，當pH=1時，550 MPa結合25 ℃/65 ℃/75 ℃處理后枯草桿菌芽孢的存活濃度為5.62、2.53、0.57 lgCFU/mL；pH=4時，550 MPa結合25 ℃/65 ℃/75 ℃處理后枯草桿菌芽孢的存活濃度為6.46、3.6、2.52 lgCFU/mL；pH=7時，550 MPa結合25 ℃/65 ℃/75 ℃處理后枯草桿菌芽孢的存活濃度為6.69、3.97、2.59 lgCFU/mL。結果表明在常溫常壓下pH單獨處理均無法造成芽孢失活。當pH=7時，550 MPa結合25 ℃處理對芽孢基本沒有殺滅效果，而pH=1和pH=4時，550 MPa結合 25 ℃ 處理對芽孢有一定的殺滅作用。當pH=4和pH=7時，550 MPa結合75 ℃處理后芽孢的殺滅效果沒有顯著變化，而pH=1時，550 MPa結合75 ℃處理后芽孢存活濃度達到最低，殺滅效果顯著增強，芽孢最多被殺滅了6.25 lgCFU/mL，這可能是因為超高壓結合低pH促使芽孢變成脫離子H-芽孢。壓力和熱會增加芽孢對質子的通透性，使得在低pH時芽孢核心部分發生再水化，說明酸性環境有利于HPTS殺滅枯草桿菌芽孢[15]。

2.2 HPTS結合不同pH處理對枯草桿菌芽孢紫外吸收物質泄漏量(OD260和OD280)的影響

260 nm和280 nm 紫外吸收物質的泄漏量常被用來檢測細胞膜通透性的變化。圖2為HPTS結合不同pH處理對枯草桿菌芽孢紫外吸收物質泄漏量(OD260、OD280)的影響。常溫常壓下，芽孢紫外吸收物質泄漏量隨著pH值降低有所增加。經HPTS結合不同pH處理后，芽孢紫外吸收泄漏量增大，說明HPTS結合不同pH對芽孢的滲透屏障都造成了一定程度的損傷。隨著pH值的降低，550 MPa結合25 ℃/65 ℃/75 ℃處理后芽孢紫外吸收物質泄漏量顯著增加，表明溫度升高到一定程度，酸會進一步破壞芽孢的滲透屏障，使得更多的核酸及蛋白質類紫外吸收物質泄漏出來。

圖1 HPTS結合不同pH處理對枯草桿菌芽孢存活濃度的影響Fig.1 Effect of HPTS combined with different pH treatments on Bacillus subtilis spore survival concentration注：圖中不同小寫字母表示組內差異顯著(P<0.05)

圖2 HPTS結合不同pH處理對枯草桿菌芽孢紫外吸收 物質泄漏量的影響Fig.2 Effect of HPTS combined with different pH treatments on the leakage of UV absorbing substances from Bacillus subtilis spores注：不同大寫字母表示OD260值組內差異顯著；不同小寫字母 表示OD280值組內差異顯著

2.3 HPTS結合不同pH處理對枯草桿菌芽孢細胞膜損傷的流式細胞儀檢測

流式細胞儀經常被用來檢測細菌細胞膜的損傷。圖3分別為HPTS結合不同pH處理芽孢后的流式細胞圖，反映芽孢內膜通透性的改變[20]。使用熒光染料PI染色后，在嵌入雙鏈DNA時會發出紅色熒光。常溫常壓下，隨著pH值降低，芽孢內膜的熒光分布沒有向M2移動，芽孢內膜通透性沒有增大，與常溫常壓下pH值單獨處理相比，當pH=1和pH=4時，550 MPa結合25 ℃處理后熒光分布基本沒有向M2移動，芽孢損傷程度較小，芽孢內膜通透性變化較小，而pH=7時，550 MPa 結合25 ℃處理熒光分布明顯向M2移動，芽孢內膜通透性增大。隨著溫度上升，HPTS結合不同pH，熒光分布明顯向M2移動，說明芽孢內膜通透性增大，這與紫外吸收泄漏量的結果相一致。與HPTS單獨作用相比，HPTS結合pH=4和pH=7處理后M2比例基本相差不大，而HPTS結合pH=1處理后M2的比例明顯增大，說明HPTS結合pH=1與相同條件下HPTS單獨處理對芽孢內膜的破壞作用更強，即可以認為HPTS結合pH=1增強了對芽孢內膜的破壞，提高了對芽孢的殺滅效果。

2.4 HPTS結合酸處理前后枯草桿菌芽孢的傅里葉紅外光譜分析

圖4為枯草桿菌芽孢在HPTS結合酸處理前后的傅里葉紅外光譜圖，紅外檢測的波長范圍為4 000～500 cm-1，本實驗選取了芽孢殺滅效果最好和內膜通透性破壞最嚴重的條件即pH=1，550 MPa結合75 ℃ 進行分析，研究HPTS在酸性條件下芽孢內膜相態及化學組分結構的變化。HPTS結合酸處理前后的紅外光譜圖的峰形、峰高變化細微，從而反映出芽孢處理前后的化學組分基本一致。為了進一步探究芽孢紅外光譜中特征波段的變化情況，需要對原紅外光譜圖進行數據分析處理。

二階導數處理是紅外譜圖分析中常用的方法[17]，它可以將原紅外譜圖中細微的差別分辨出來，有利于深入分析原紅外譜圖。圖5-a反映了芽孢內膜脂肪酸相變化情況。波數大約在2 872、2 960 cm-1的譜帶分別表示CH3基團對稱和反對稱伸縮振動；波數約為2 852、2 919 cm-1的譜帶分別表示CH2基團對稱和反對稱伸縮振動[21]，與未處理和HPTS處理的枯草桿菌芽孢相比，HPTS結合酸處理后，原2 960、2 919 cm-1處的紅外吸收峰發生了移動，紅外吸收峰強度變化更加劇烈。以上紅外吸收峰反映了芽孢內膜的相變化。圖5-a表明，芽孢內膜磷脂的不流動性是由于其磷脂處于凝膠態[22]，經過HPTS結合酸處理后，芽孢內膜的磷脂分子疏水尾鏈混亂度增大，磷脂由凝膠態變為液晶態，從而流動性增加，最終導致芽孢內膜水分子通透屏障的受損。

a-pH=1、25 ℃處理；b-pH=4、25 ℃處理；c-pH=7、25 ℃處理；d-pH=1、550 MPa、25 ℃處理；e-pH=4、550 MPa、25 ℃處理； f-pH=7、550 MPa、25 ℃處理；g-pH=1、550 MPa、65 ℃處理；h-pH=4、550 MPa、65 ℃處理；i-pH=7、550 MPa、65 ℃處理； j-pH=1、550 MPa、75 ℃處理；k-pH=4、550 MPa、75 ℃處理；l-pH=7、550 MPa、75 ℃處理圖3 HPTS結合不同pH處理對枯草芽孢桿菌芽孢內膜通透性的影響Fig.3 Effects of HPTS combined with different pH treatments on the membrane permeability of Bacillus subtilis spores注：M1代表熒光強度較低的陰性區域；M2代表熒光強度較高的陽性區域

圖4 HPTS結合酸處理前后枯草桿菌芽孢的紅外光譜圖Fig.4 FT-IR spectra of Bacillus subtilis spores before and after HPTS combined with acid treatment

圖5-b反映了芽孢蛋白酰胺Ⅰ帶的蛋白質二級結構變化。從圖5-b中可以看出，HPTS結合酸處理后，1 674 cm-1處的紅外吸收峰發生了明顯的變化，從未處理的1 674 cm-1處移動到1 676 cm-1處；1 652 cm-1的紅外吸收峰移動到了1 650 cm-1；1 644 cm-1的紅外吸收峰移動到了1 646 cm-1處，其中1 674 cm-1的吸收峰代表蛋白質β折疊結構，1 652、1 644 cm-1代表蛋白質的α螺旋結構[23]。由此表明，經過HPTS結合酸處理后，紅外吸收峰的位置和峰形均發生了明顯的變化，芽孢蛋白質的二級結構遭到破壞，蛋白質發生了變性。原因可能是酸改變了芽孢內膜的電荷，影響其正常生理功能，同時，酸性條件改變了氨基酸分子側鏈的電離狀態，從而導致蛋白質構象的改變[15]，在高壓和溫度作用下，芽孢蛋白質更容易發生變性。

a-3 000～2 800 cm-1波段；b-1 700～1 600 cm-1波段；c-1 300～900 cm-1波段圖5 HPTS結合酸處理前后枯草桿菌芽孢的二階導數紅外光譜圖Fig.5 Second-derivative infrared spectra of Bacillus subtilis spores before and after HPTS combined with acid treatment

3 結論

(1)將芽孢懸浮液的pH值調整為1、4、7，于550 MPa 結合25、65、75 ℃處理20 min，平板計數結果表明，常溫常壓下pH值單獨處理均無法造成芽孢失活。當HPTS結合不同pH處理后，隨著pH值降低，芽孢的殺滅效果明顯增強，當pH=1時，550 MPa結合75 ℃ 條件下芽孢最多被殺滅了6.25 lgCFU/mL。

(2)對芽孢紫外吸收物質泄漏量和內膜通透性研究發現，常溫常壓下，芽孢紫外吸收物質泄漏量隨著pH值降低有所增加；相比HPTS單獨作用，HPTS結合不同pH處理后，芽孢紫外吸收泄漏量大幅增加，pH值越低，芽孢紫外吸收泄漏量越大。常溫常壓下，隨著pH值降低，芽孢內膜通透性沒有增大；隨著溫度上升，HPTS結合不同pH處理后芽孢內膜通透性增大；HPTS結合pH=4和pH=7處理后，陽性區域比例基本相差不大，而HPTS結合pH=1處理后陽性區域的比例明顯增大，表明芽孢內膜通透性顯著增加，芽孢內膜結構遭到破壞，這與芽孢紫外吸收物質泄漏量的結果相一致。

(3)對不同處理后的芽孢的傅里葉紅外光譜分析發現，相比對照組和HPTS單獨作用，HPTS結合酸處理后，芽孢內膜磷脂相態發生轉變，磷脂由凝膠態變為液晶態，膜脂流動性增加；芽孢蛋白質二級結構變化，導致蛋白質變性；芽孢內核酸物質變性，皮層肽聚糖和細胞壁結構改變。

綜上所述，芽孢內膜的極端不通透性和膜脂的不流動性是芽孢難以被殺滅的重要原因，本實驗圍繞芽孢內膜進行研究，發現單獨pH處理無法對芽孢內膜造成損傷，而在HPTS單獨作用的基礎上，HPTS結合酸使芽孢內膜通透性顯著增加，膜脂的流動性增加，推測是因為HPTS促使芽孢快速萌發，并對內膜造成損傷后，低pH進一步破壞芽孢內膜的水分子通透屏障，使得水分子更容易透過芽孢內膜進入芽孢內核，芽孢內核含水量不斷增加，芽孢自身的極端抗性就會大大降低，進而可以有效殺滅芽孢，這對于研究芽孢殺菌抗性及HPTS在殺滅細菌芽孢上的應用提供了一定的理論依據。