黃腐酸處理對塔羅科血橙成熟過程中花色苷和糖酸積累的影響

賀明陽，喻最新，姚世響，王日葵，周煉，鄧涂靜，洪敏*

1(西南大學 柑桔研究所，重慶，400712)2(中國農業科學院柑桔研究所，重慶，400712)3(中國科學院華南植物園植物資源保護 與可持續利用重點實驗室，廣東 廣州，510650)4(西南大學 食品科學學院， 重慶，400715)

血橙(CitrussinensisL.Osbeck)屬甜橙類，果肉含有紅色血絲，肉質細嫩化渣，具有獨特的玫瑰香氣[1]。常見的血橙品種有塔羅科(Tarocco)、桑吉耐洛(Sanguinello)和摩洛(Moro)[2-3]。血橙是富含花色苷的柑橘[4]，其較低的糖酸比使果實風味減弱[3]。花色苷是血橙中主要的抗氧化活性成分，能夠清除自由基[5]，還能預防肥胖癥、糖尿病、癌癥、抗炎癥等[3,6]，其含量是評價血橙商業價值的重要指標[7]。研究證明血橙花色苷的積累是冷調控過程[8]，依賴較大晝夜溫差，熱帶/亞熱帶氣候下種植的血橙普遍著色不夠，限制了血橙商業生產的地理種植[6]。目前柑橘產業發展迅速，消費市場對果實品質要求更高。因此，如何促進血橙增糖著色、提升果實鮮食品質，值得探究。

黃腐酸(fulvic acid, FA)是腐植酸中水、酸、堿都可溶的組分，含有羧基、酚羥基和醌基等活性基團[9]，具有較強的絡合、螯合和表面吸附能力，與氮磷鉀等礦質元素互溶，分子質量小，滲透能力強，容易被植物吸收[10]。研究表明，FA能夠促進植物生長[11]、提高作物抗逆性[12-13]、增加產量[9,11]、改善果實糖酸比和味感[12,14]。此外，FA對環境友好、人類健康安全[13]，且有研究表明FA具有抗炎癥、治療糖尿病的功效[15]。目前，FA處理對血橙成熟過程中花色苷和糖酸積累變化的研究還鮮有報道。

本研究選用我國主要栽培的塔羅科血橙為試材，于果實轉色期后(花后230 d)葉面噴施FA。運用HPLC和實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)技術探究血橙成熟過程中(花后230～324 d)果實花色苷和糖酸含量等品質指標變化及相關代謝基因的表達模式，為改善血橙品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

試驗于2016—2018年在重慶市璧山區綠躍血橙種植園進行，供試材料為30年生塔羅科血橙，開花時間為4月23日。預實驗研究發現，花后230 d葉面噴施1 g/L FA(含FA質量分數為90%，上海通微生物技術有限公司)能明顯改善血橙果實品質，且效果最佳。因此本研究選取樹勢一致、常規管理的血橙植株，于果實轉色期后(花后230 d)葉面噴施1 g/L FA(為FA組)，噴施清水為CK組。至果實完全成熟(花后324 d)，期間每隔15 d左右取1次樣。選取大小適中、無病蟲害和機械損傷的果實，3棵樹為1次重復，每次重復15個果子，設3次重復。采后當天運回實驗室，部分樣品取果肉用液氮速凍后于-80 ℃保存，部分樣品榨汁后測定相關指標。

1.2 儀器與設備

H1850R臺式高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；TU-1901紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；CFX96TM實時熒光定量PCR儀，美國伯樂公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 光譜法測定血橙果汁總花色苷含量

血橙果汁總花色苷含量的測定選用光譜法[1]。血橙鮮果榨汁后10 000 r/min離心10 min。各取2 mL上清液，分別用緩沖液A(0.05 mol/L KCl、0.15 mol/L HCl，pH=1.0)和緩沖液B(0.4 mol/L CH3COONa、0.24 mol/L HCl，pH=4.5)稀釋至10 mL。最后于510 nm和700 nm處分別測定吸光度值。結果計算如公式(1)所示：

(1)

式中：ΔA=(A510 nm-A700 nm)pH 1.0-(A510 nm-A700 nm)pH4.5;DF是稀釋倍數;484.82是矢車菊素-3-葡萄糖苷分子質量;24 825是其摩爾吸光系數。

1.3.2 HPLC測定血橙果肉可溶性糖和有機酸含量

糖、酸的提取參考ZHANG等[16]和鄭惠文等[17]的方法。稱取3 g研磨成粉末的果肉樣品，加入5 mL 80%(體積分數)冰乙醇。35 ℃水浴浸提20 min，室溫5 000 r/min離心5 min后取上清液，重復抽提3次，合并上清液后定容至20 mL。取5 mL提取液，室溫5 000 r/min離心5 min。然后取3 mL上清液在35 ℃下旋轉蒸干，最后用1.5 mL雙蒸水溶解，過0.22 μm 的濾膜。

色譜條件參考喻最新等[7]的方法。可溶性糖測定的色譜條件：色譜柱選用APS-2HYPERSIL柱(260 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫35 ℃，流動相為V(乙腈)∶V(水)=70∶30，流速為1.0 mL/min，進樣量為10 μL，示差折光檢測器(refractive index detector，RID)。抗壞血酸測定的色譜條件：色譜柱選用UMISILC18(2)柱(260 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫25 ℃，流動相為V(甲醇)∶V(0.1%磷酸)=1∶99，流速為0.8 mL/min，進樣量為10 μL，檢測波長為245 nm。檸檬酸、蘋果酸測定的色譜條件：色譜柱選用Venusil MP C18柱(260 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫40 ℃，流動相為V(甲醇)∶V[0.05 mol/L KH2PO4溶液(pH 2.5)]=97∶3，流速1 mL/min，檢測波長為210 nm，進樣量為20 μL。

總糖、總酸含量為各組分含量之和。

1.3.3 血橙果肉總RNA提取及cDNA合成

果肉總RNA提取參考天根植物多糖多酚總RNA提取試劑盒(DP441型)的產品說明，然后經Tiangen FastKing RT Kit (with gDNase)(KR116型)試劑盒反轉錄成cDNA，-20 ℃保存備用。

1.3.4 qRT-PCR測定基因表達水平

血橙花色苷及糖酸代謝相關基因引物序列分別參考CARMONA等[6]和LIU等[18]，內參基因選用EF-1α[8](Accession No.XM_015533332)。參照寶生物SYBR?PremixExTaqTMII的說明操作，在實時熒光定量PCR儀上反應。反應體系如下：10 μL SYBR Green I mix，0.8 μL正向引物，0.8 μL反向引物，1.5 μL cDNA模板，6.9 μL ddH2O。操作程序如下：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，58 ℃、30 s，經40個循環反應。融解曲線繪制：95 ℃、10 s，降溫到65 ℃后開始以0.5 ℃每步升溫，并維持5 s采集熒光信號，反應至95 ℃結束。每個樣品3次重復。采用2-ΔΔct法進行相對定量分析。

1.3.5 數據處理

選用Microsoft Excel 2007進行數據處理，并執行單因素方差分析(P<0.05)，選用Origin 9繪圖。

2 結果與分析

2.1 FA處理對血橙果汁總花色苷含量及果實著色的影響

由圖1可知，血橙成熟過程中，FA處理組花色苷含量始終顯著高于CK組。花后324 d，FA組花色苷含量為48.92 mg/L，比CK組提高了153.7%。結果表明，花后230 d葉面噴施FA能顯著促進血橙果實花色苷積累。花色苷屬黃酮類化合物[7]。XU等[13]發現FA處理對葡萄苯丙烷代謝相關酶活性以及終產物的積累具有誘導作用，能夠提高鮮食葡萄總黃酮含量。

由圖2可知，花后230～324 d，FA組和CK組果實的果肉以及果汁顏色均越來越深。花后230 d，FA組和CK組果肉均未著紅色。花后243 d，FA組開始出現紅血絲，CK組仍未著紅色。花后261～324 d，FA組和CK組果肉均含有紅血絲，果汁顏色越來越紅，且FA組血橙果肉和果汁顏色明顯比CK組紅。花色苷含量變化與血橙果肉以及果汁顏色的變化進程基本一致。

圖1 黃腐酸處理對血橙成熟過程中果汁花色苷含量的影響Fig.1 Effects of preharvest application of fulvic acid on anthocyanin content in maturing Tarocco blood oranges注：*表示同一時期2組果實在P<0.05水平上存在顯著差異(下同)

2.2 FA處理對血橙花色苷合成相關結構基因表達水平的影響

血橙花色苷代謝途徑已闡明[6,19]。莽草酸途徑連接糖代謝與次生代謝，糖酵解途徑產生的磷酸烯醇式丙酮酸和戊糖磷酸途徑產生的赤蘚糖-4-磷酸進入莽草酸途徑生成苯丙氨酸[20]。苯丙氨酸作為最直接的前體物質，經苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)、肉桂酸4-羥化酶(cinnamate 4-hydroxylase, C4H)、CoA連接酶(4-hydroxy-cynnamoyl CoA ligase, 4CL)、查爾酮合成酶(chalcone synthase, CHS)、查爾酮異構酶(chalcone isomerize, CHI)、黃酮醇3-羥化酶(flavonone 3-hydroxylase, F3H)、類黃酮3-羥化酶(flavonoid 3′-hydroxylase, F3′H)、類黃酮3,5-羥化酶(flavonoid 3′5′-hydroxylase, F3′5′H)等催化生成二氫黃酮醇。二氫黃酮醇可經黃酮醇合成酶(flavonol synthase, FLS)催化形成黃酮醇，或是在二氫黃酮醇4-還原酶(dihydroflavonol 4-reductase, DFR)催化下生成無色花青素。無色花青素經花青素合成酶(anthocyanin synthase, ANS)及糖基轉移酶(UDP-glucose-flavonoid 3-O-glucosyltransferase, UFGT)作用生成穩定的花色苷，最后經谷胱甘肽轉移酶(glutathione-S-transferases, GST)轉至液泡儲存。

由圖3可知，血橙成熟過程中FA組和CK組的12個基因表達水平基本呈現先上升后下降的趨勢，該結果與喻最新等[7]研究一致。FA處理后，4CL表達量在花后261、276、293、324 d顯著上調，分別為CK組的1.84、1.49、1.74、3.65倍；CHS表達量在花后243、261、293、324 d顯著上調，分別為CK組的1.58、1.29、2.17、1.66倍；DFR表達量在花后243、276、309、324 d顯著上調，分別為CK組的1.59、1.55、1.46、2.30倍；ANS表達量在花后243、261 d顯著上調，分別為CK組的1.80、2.55倍；UFGT表達量在花后243、261、324 d顯著上調，分別為CK組的1.68、2.21、2.10倍；GST表達量在花后243、261、276、324 d顯著上調，分別為CK組的2.82、3.64、2.09、1.96倍；且這些基因在其他時期與CK組表達豐度基本一致。綜合分析認為，花后230 d葉面噴施FA能夠激活4CL、CHS、DFR、ANS、UFGT、GST的表達，認為這些基因是FA調控血橙花色苷合成的關鍵結構基因。另外，FA處理誘導F3′5′H、ANS、GST及UFGT的表達峰值提前了32 d，F3H的表達峰值提前了15 d。XU等[13]研究發現FA處理顯著誘導了葡萄果皮中PAL、C4H、4CL、CHS表達的上調，研究結果與本研究結果相互印證。

二氫黃酮醇的轉化是類黃酮代謝途徑中的一個重要節點[7]。本研究發現血橙成熟過程中FA組DFR與FLS表達水平的比值始終高于CK組，表明FA處理使血橙類黃酮代謝途徑朝著無色花青素方向進行，且隨著ANS、UFGT及GST表達水平顯著上調，促進了無色花青素合成穩定的花色苷。該結果與低溫對血橙花色苷的調控機制相似[6]。

A～L-基因分別為PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3′5′H、FLS、DFR、ANS、UFGT、GST圖3 黃腐酸處理對血橙成熟過程中花色苷合成相關結構基因表達水平的影響Fig.3 Effects of preharvest application of fulvic acid on transcription levels of anthocyanins biosynthesis related structural genes in maturing Tarocco blood oranges

2.3 FA處理對血橙果肉可溶性糖含量的影響

糖是柑橘果實品質最主要的指標之一，柑橘果實主要積累蔗糖、果糖和葡萄糖等可溶性糖。由圖4可知，花后230 d，蔗糖、果糖和葡萄糖含量比例約為2∶1∶1，龔榮高等[21]在甜橙果實膨大后期也發現該結果。花后324 d，FA組總糖、果糖、葡萄糖、蔗糖質量分數分別為75.33、20.87、20.22、33.84 mg/g，比CK組分別提高了10.2%、15.1%、14.5%、6.7%。花后261 d，FA組總糖、蔗糖、果糖、葡萄糖含量雖高于CK組，但無顯著差異。花后243、276、293、309、324 d，FA組總糖、蔗糖、果糖、葡萄糖含量均顯著高于CK組，表明FA處理顯著提高了血橙成熟過程中可溶性糖含量。彭玲等[9]和張玲[12]在蘋果果樹中施用FA后也發現果實中有相似結果。另外，整個血橙成熟過程中果糖、葡萄糖積累變化量明顯高于蔗糖，表明蔗糖在合成的同時也在分解[22]。可溶性糖是反應甜度的適宜指標，其含量增加可提升血橙甜度和口感[23]。

2.4 FA處理對血橙蔗糖代謝相關基因表達水平的影響

蔗糖代謝是柑橘糖積累的重要過程[21]，主要由蔗糖合成酶(sucrose synthase, SS)、蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase, SPS)和酸性轉化酶(acid invertase, AI)等關鍵酶催化[18]。蔗糖合成與分解受SS可逆調控[21]。蔗糖經轉化酶催化水解生成果糖和葡萄糖的反應不可逆[22]。由圖5可知，花后243、261、276、293、324 d，FA組AI表達量顯著高于CK組。FA處理對血橙成熟過程中SS、SPS的表達水平無明顯促進作用，而蔗糖含量卻顯著增加。邱文偉等[24]發現除了糖代謝酶的成分與活力外，韌皮部后運輸是葉源光合同化產物進入汁囊的限速階段，跨膜運輸是果實細胞糖分積累的控制點。綜合分析認為，FA處理可能通過激活AI表達來加快蔗糖水解，產生的蔗糖濃度梯度為蔗糖跨膜運輸提供了動力[25]，加快了韌皮部后運輸速率及跨膜運輸能力，以此來增加果實細胞中可溶性糖總量的積累。

A-總糖；B-蔗糖；C-果糖；D-葡萄糖圖4 黃腐酸處理對血橙成熟過程中可溶性糖含量的影響Fig.4 Effects of preharvest application of fulvic acid on soluble sugar content in maturing Tarocco blood oranges

A～E-基因分別為AI、SS1、SS2、SPS1、SPS2圖5 黃腐酸處理對血橙成熟過程中蔗糖代謝相關基因表達水平的影響Fig.5 Effects of preharvest application of fulvic acid on transcription levels of sucrose metabolism related genes in maturing Tarocco blood oranges

2.5 FA處理對血橙果肉有機酸含量的影響

由圖6可知，血橙成熟過程中，FA組和CK組果實總酸、檸檬酸、抗壞血酸、蘋果酸含量基本呈下調趨勢，且2組果實總酸、檸檬酸含量無顯著差異。YAO等[26]也發現果實成熟后期檸檬酸含量降低，可能與參與三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)循環為細胞供能、氨基酸代謝[26]以及γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)支路[27]等有關。花后276、324 d，FA組抗壞血酸含量顯著高于CK組，其他時期無顯著差異。花后324 d，FA組蘋果酸含量顯著高于CK組，其他時期無顯著差異。由于檸檬酸是柑橘中主要的有機酸，所以認為FA處理對血橙成熟過程中有機酸含量的影響不顯著。

A-總酸；B-檸檬酸；C-蘋果酸；D-抗壞血酸圖6 黃腐酸處理對血橙成熟過程中有機酸含量的影響Fig.6 Effects of preharvest application of fulvic acid on organic acid content in maturing Tarocco blood oranges

2.6 FA處理對血橙檸檬酸代謝相關基因表達水平的影響

檸檬酸是柑橘中主要的有機酸，由乙酰輔酶A與草酰乙酸在線粒體檸檬酸合成酶(citrate synthase，CS)的催化下縮合合成，通過TCA循環催化，主要儲存在液泡中[28-29]。檸檬酸的降解主要由烏頭酸酶(aconitase，AC)、異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)等催化[28]。由圖7可知，在花后243～261 d，FA處理抑制了CS、AC表達，在花后309 d，FA誘導CS、AC表達上調。FA組IDH表達量在花后243、261、293 d顯著低于CK組，在花后324 d，FA組IDH表達量顯著高于CK組。總的來說，FA處理后CS、AC、IDH調控檸檬酸積累的作用不大。

A～C-基因分別為CS、AC、IDH′圖7 黃腐酸處理對血橙成熟過程中檸檬酸代謝相關基因表達水平的影響Fig.7 Effects of preharvest application of fulvic acid on transcription levels of citric acid metabolism related genes in maturing Tarocco blood oranges

3 結論

本研究通過轉色期后(花后230 d)葉面噴施FA，顯著提高了血橙成熟過程中總糖、果糖、葡萄糖、蔗糖的含量，可溶性糖積累與AI表達水平相關。FA處理對總酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸含量的影響不顯著，CS、AC、IDH調控檸檬酸積累的作用不大。糖是評價柑橘果實風味和整體品質的重要指標，也是合成花色苷的原料[19]，不僅通過糖酵解連接莽草酸途徑來影響花色苷代謝[20]，還作為信號分子調控花色苷合成相關基因的表達[7]。因此，FA可能通過提高血橙果實中的蔗糖、葡萄糖、果糖含量使總糖含量增大，進而使果實中合成花色苷的底物增多，或是通過提高血橙中可溶性糖的含量激活了花色苷合成相關的信號轉導途徑，誘導4CL、CHS、DFR、ANS、UFGT、GST表達上調從而使血橙中花色苷含量增加。

總之，葉面噴施FA提高了血橙成熟過程中花色苷和糖的積累，促進血橙增糖著色，對酸積累也無不利影響，其中AI、4CL、CHS、DFR、ANS、UFGT、GST是調控花色苷和糖積累的關鍵基因。本研究闡釋了FA對血橙成熟過程中花色苷和糖酸積累的影響及相關代謝基因的表達特征，為進一步改善血橙品質提供理論依據。