4-羥基異亮氨酸無抗發酵的菌株構建和上罐條件優化

魏舒宇，史鋒*

1(江南大學，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

4-羥基異亮氨酸(4-hydroxyisoleucine，4-HIL)是一種天然的非蛋白質氨基酸，被首次發現于葫蘆巴種子中[1]。4-HIL具有降低胰島素抵抗、治療高血脂和代謝紊亂等非傳染性疾病，是一種治療Ⅱ型糖尿病[2]及其并發癥的潛在藥物，具有非常廣闊的應用前景[3-4]。4-HIL具有8種立體異構體，研究表明，其中具有治療糖尿病作用的結構僅為(2S, 3R, 4S)-4-HIL一種構型[5]。

最早期生產4-HIL的方法主要采用胡蘆巴種子提取法，但是該生產方法存在原料需求量大、雜質多導致分離純化較為困難、最終收率較低和成本昂貴等缺點[1]。利用化學-酶合成法可以較大的提升產品的最終得率[6]，但也存在操作繁瑣、耗時較長以及產品純度較低等缺點，不利于工業化的大規模生產。2009年，KODERA等[7]在Bacillusthuringiensis2e2中發現了異亮氨酸雙加氧酶(isoleucine dioxygenase，IDO)。IDO可以直接特異性催化異亮氨酸(isoleucine，Ile)的C4發生羥基化，從而生成(2S, 3R, 4S)-4-HIL。IDO的催化生產不會產生4-HIL的其他構型，自身也具備易獲取、催化過程簡單和生產成本少等特點，最適合用來工業化生產4-HIL[8]。

本實驗室前期通過在Ile生產菌株C.glutamicumssp.lactofermentumSN01(以下簡稱為SN01)中表達ido基因，構建了重組菌株SN02，利用自身合成的Ile催化合成得到(65.44±2.27) mmol/L的4-HIL，實現了4-HIL的從頭生物合成[9]。為了增加Ile的供應，過表達天冬氨酸激酶編碼基因lysC；為了增強ido表達，過表達韋氏芽孢桿菌中的ido3基因，構建了質粒pJYW4-ido-lysC-ido3[10]。

在很早之前，抗生素的過度使用而引起的抗生素抗性基因擴散便引發了人們的廣泛關注?？股乜剐曰虻臄U散會引起大量具有抗性的微生物產生，在疫苗和醫藥衛生領域，這種抗生素耐藥菌株的擴散可能會引起更大的危害[11-12]。谷氨酸棒桿菌的表達質粒中攜帶有抗生素抗性基因作為篩選標記。通常在發酵過程中，為了維持菌株中質粒的穩定性和活性，需要在培養基中添加一定濃度的抗生素。這不僅增加了抗生素抗性基因擴散的風險，還增加了生產成本[13]。alr基因編碼丙氨酸消旋酶，參與催化將L-丙氨酸轉化為D-丙氨酸的反應，D-丙氨酸為谷氨酸棒桿菌中細胞壁肽聚糖交聯及前體合成的必需物質[14-15]。在谷氨酸棒桿菌中敲除alr后，菌株自身沒有其他途徑進行回補，所以在培養基上表現為穩定的營養缺陷型菌株。隨后通過在表達質粒中表達alr基因對敲除菌株進行回補，就能使質粒在不添加抗生素的情況下仍能穩定地維持在細胞中。

為了提高4-HIL的產量以及減少抗生素在發酵過程中的使用，首先在谷氨酸棒桿菌SN01中敲除丙氨酸消旋酶基因alr，并使用質粒pJYW4-ido來回補alr基因并表達異亮氨酸雙加氧酶IDO，該方法有效地減少了發酵過程中抗生素的使用，成功地使谷氨酸棒桿菌菌株正常生長并且生產4-HIL。在SN01Δalr菌株中轉入pJYW4-ido-lysC-ido3質粒后，從接種時的種子活力、溶氧水平的調整和補料等方面進行上罐水平的優化，從而提高4-HIL的上罐產量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

本課題所構建的菌株如表1所示。

表1 本課題所用菌株Table 1 Strains used in this study

1.1.2 實驗試劑

七水合硫酸亞鐵、氯化鈉、氨水、硫酸銨,中國醫藥集團有限公司；酵母浸粉、蛋白胨，英國OXOID公司；發酵培養基所使用的阿拉丁玉米漿，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸吡哆醛、甜菜堿，美國TEDIA公司。

1.1.3 培養基配方和培養條件

谷氨酸棒桿菌發酵過程中種子培養基(g/L)：固體玉米漿40、磷酸二氫鉀1、硫酸氨0.5、尿素1.25、葡萄糖25、硫酸鎂0.5。固體玉米漿使用前攪拌混勻，培養基定容后，pH約為3.8，用氫氧化鉀調節至pH 7.2。121 ℃，15 min條件滅菌。

上罐發酵培養基(g/L)：葡萄糖100，硫酸氨20，玉米漿15，磷酸二氫鉀1，無水硫酸鎂0.75，酵母粉3，維生素B11.0×10-3，甜菜堿1.5×10-3，七水合硫酸亞鐵1.1。用氫氧化鉀調節至pH 7.2，滅菌條件115 ℃，15 min。

培養谷氨酸棒桿菌抗生素添加量：氯霉素10 μg/mL，卡那霉素30 μg/mL。

谷氨酸棒桿菌培養條件：自動往復式搖床30 ℃，200 r/min。

敲除alr基因的重組菌株在發酵過程中無需向培養基中添加抗生素。

1.2 實驗方法

1.2.1alr基因敲除菌株及發酵菌株的構建

alr基因的敲除按照胡瑾瑜[16]所構建的谷氨酸棒桿菌基因敲除方法進行。隨后在SN01Δalr中使用電轉的方法分別轉入pJYW4-ido以及pJYW4-ido-lysC-ido3質粒，構建出了Δalr/p4-ido和Δalr-ILI3菌株。這兩個質粒所用的載體pJYW-4上攜帶有alr基因表達框[17]。

1.2.2 谷氨酸棒桿菌上罐發酵

谷氨酸棒桿菌上罐發酵具體步驟如下，使用迪必爾生物公司2 L四連罐：

(1)活化菌株：將保存于-80 ℃冰箱中的菌株涂布于LBB固體培養基平板上活化48 h。

(2)種子培養；將平板上已經活化好菌苔接種于含有50 mL種子培養基的500 mL發酵搖瓶中，在往復式搖床中30 ℃，200 r/min培養至上罐所需要的種子濃度。

(3)發酵罐培養：將生長至對數期的種子液接種于滅菌完成的發酵罐中，進行發酵罐上的菌株培養，一個發酵周期為96 h。

發酵過程中pH調節試劑：體積分數為25%的氨水。

發酵過程補料試劑：800 g/L葡萄糖。當發酵罐內葡萄糖質量濃度低于20 g/L時，將葡萄糖補加到30 g/L。

1.2.3 發酵參數測定

發酵過程中每4 h取1次樣，測量OD562值、殘糖和氨基酸含量。

OD562值：將樣品稀釋一定倍數，用紫外分光光度計在562 nm處進行OD值的測量。

殘糖：將發酵樣品用離心機12 000 r/min，15 min離心，減少大分子物質對還原糖測定儀的損傷，取10 μL 的發酵上清液用ddH2O稀釋100倍后，再使用生物傳感儀SBA40測定殘留葡萄糖數值濃度。

氨基酸含量測定：將發酵液樣品進行預處理并稀釋一定倍數后使用高效液相色譜測定樣品中的氨基酸含量。首先進行各個氨基酸標樣的液相測定，確定各個氨基酸的出峰時間和峰面積，然后進行發酵樣品的液相測定，將某種氨基酸樣品的峰面積和標樣中該氨基酸的峰面積進行比值再乘以稀釋倍數，從而計算出該種氨基酸在樣品中的含量。

2 結果與分析

2.1 敲除alr對4-HIL發酵的影響

alr作為一種替代抗生素的選擇標記，其實用性已在其他谷氨酸棒桿菌中得到驗證[17-18]。從實驗嚴謹性以及敲除alr之后的發酵效果考慮，有必要驗證在SN01中敲除alr后菌株受到的影響，以及質粒所攜帶的alr能否回補alr敲除菌體的D-丙氨酸營養缺陷。

2.1.1alr敲除對菌株生長的影響

在alr基因敲除菌株基礎上過表達ido基因，得到重組菌株Δalr/p4-ido，該菌株的質粒上同時攜帶了alr基因表達框。在不添加卡那霉素的情況下，經過搖瓶發酵144 h后，菌株Δalr/p4-ido的生長和糖耗情況如圖1所示。以攜帶pJYW4-ido質粒的野生菌SN02在添加卡那霉素時的發酵作為對照。

a-生長變化；b-殘糖變化圖1 SN02和alr敲除菌株Δalr/p4-ido發酵過程中 生長和殘糖變化Fig.1 Cell growth and residual glucose of SN02 and alr-deleting strain Δalr/p4-ido during the fermentation

在整個發酵周期中，菌株Δalr/p4-ido與對照菌株SN02保持相似的生長趨勢。而且在96 h之前，Δalr/p4-ido菌株的生長速率略微高于對照菌株，最終兩者的生物量幾乎相同，OD562值都在115左右。生長速率的變化說明敲除alr基因并沒有影響菌株的生長。在耗糖能力方面，SN02和Δalr/p4-ido在0～72 h耗糖速率幾乎相同，在72 h時都能將葡萄糖耗盡，該結果說明，敲除了alr基因后，通過質粒pJYW4-ido回補alr基因并沒有阻礙菌株的生長狀況，菌株的耗糖能力也沒有減弱。在產量方面，菌株Δalr/p4-ido發酵144 h后的4-HIL產量為152.59 mmol/L，對照菌株SN02的4-HIL產量為147.79 mmol/L，產量無明顯波動，說明該方法對4-HIL的生產無明顯不良影響。

2.1.2alr回補替代抗生素使用的效果

隨后驗證alr敲除之后，通過轉入攜帶alr基因的質粒pJYW4-ido進行回補是否能夠不用添加卡那霉素就保持質粒穩定存在，從而有效地替代發酵過程中抗生素的使用。取正常發酵144 h后菌株Δalr/p4-ido先稀釋至OD562值為1，然后再稀釋一定倍數后分別涂布于含有或不含有卡那霉素的平板，觀察兩種平板上菌落生長的情況，結果如表2所示。

表2 alr敲除菌的質粒穩定性Table 2 Plasmid stability of alr knockout bacteria

從表2中可以看出，alr敲除后的回補菌株Δalr/p4-ido在含有抗生素的平板上長出的菌落數(這些菌株中質粒存在)幾乎接近于在不含有抗生素的平板上長出的菌落數(包括質粒存在的菌株和質粒丟失的菌株)，說明在谷氨酸棒桿菌的144 h的發酵周期內，alr敲除回補菌中的質粒能夠穩定存在，可以使用alr敲除菌株并使用攜帶alr基因的質粒進行回補，以此代替抗生素的使用來維持質粒穩定存在。

2.2 上罐水平上的發酵條件優化

在構建SN01Δalr的基礎上使用電轉的方法轉入pJYW4-ido-lysC-ido3質粒，構建出了Δalr-ILI3菌株。對該菌株進行上罐條件的優化。

2.2.1 菌株Δalr-ILI3種子生長時間對發酵生產4-HIL的影響

針對種子活力，主要通過選擇不同的種子生長時間進行接種。以Δalr-ILI3為發酵菌株，分別選16、18、18.5、19.5、21 h的種子生長時間進行接種，上罐發酵的結果如圖2和圖3所示。

a-生長情況；b-耗糖情況圖2 菌株Δalr-ILI3不同種子活力時上罐發酵的生長和耗糖Fig.2 Fermentation of strain Δalr-ILI3 with different seed cultivation time in 2 L fermenters

圖3 種子培養18 h上罐發酵的氨基酸產量Fig.3 The amino acid production of strain Δalr-ILI3 with 18 h seed cultivation time in a 2 L fermenter

從圖2可以看出，在只變動種子生長時間的條件下，生長狀況和4-HIL產量顯著不同。當種子生長時間為18 h時菌株在發酵罐上的生長最好。種子生長時間為16 h的菌株延滯期過長，生長速率緩慢，最終沒有完全生長起來。而種子生長時間為18.5、19.5、21 h的種子液活力完全不足，在菌株還沒有生長起來的時候就進入了衰亡期，最終也沒有4-HIL產量。在測定菌株Δalr-ILI3的生長曲線時發現：種子液培養18 h已經是對數期后期了，過早接種會使菌株的延滯期變長，超過18 h接種也會降低菌株的活力。從圖3中可以看出，正常生長起來的菌株發酵16 h之后，當菌株的OD562值超過50之后，開始積累4-HIL。在48 h進入穩定期，OD562值在145左右進行波動。在48 h之前，4-HIL的產量只是在緩緩積累，主要能量還是提供給菌株的生長和Ile的積累，在48 h時4-HIL和Ile的產量分別34.69、113.74 mmol/L。當菌株進入穩定期之后，4-HIL的積累速度加快，分別在48～72 h以及84～96 h，4-HIL積累的速度最快。最終4-HIL的產量為242.18 mmol/L，Ile剩余47.33 mmol/L。L-異亮氨酸在發酵進行至96 h還有剩余，說明在發酵過程中IDO的活性不足以在短時間內將全部的Ile轉化為4-HIL，所以后續將以增加IDO活性為目的進行研究實驗。

2.2.2 菌株Δalr-ILI3溶氧水平改變對發酵生產4-HIL的影響

為了提高菌株Δalr-ILI3的生產效率，需要加強其IDO的活性。IDO是一種雙加氧酶，它催化的反應會消耗O2并產生CO2，有研究表明進行兩階段溶氧的調節有助于4-HIL生產水平的提高[19]。在發酵進入到中期時，菌株在合成4-HIL時，需要消耗大量的O2，為了使反應正常進行，需要在4-HIL積累過程中提高發酵罐中的O2供給量，使反應能夠順利進行。針對Δalr-ILI3菌株的發酵情況：在發酵早期，較低的溶氧值會使菌株的生長變得緩慢，不利于Ile的積累和4-HIL的生產，而過高的溶氧值會使得菌株隨著氣泡附著在液面之上的發酵罐壁上，嚴重影響菌株的生長。所以在發酵初期選擇20%溶氧，以便使菌株能夠正常生長并且不會使大量菌株附著在發酵罐壁上。在發酵中期，隨著菌株生物量生長至OD562值超過50以后，逐漸開始積累4-HIL，這時產生大量氣泡。此時如果溶氧值不夠會阻礙4-HIL的積累，溶氧值過高會發生噴罐。當溶氧值上升至35%時，氣泡已經升至發酵罐頂層，所以為了提高試驗的成功率和4-HIL產量，選擇30%為提升后的溶氧值。綜上所述，實驗以Δalr-ILI3為發酵菌株，在菌株OD562值達到50以上時，將設定的溶氧值由20%提高至30%，發酵結果如圖4所示。

a-菌株生長和殘糖情況；b-菌株氨基酸產量圖4 菌株Δalr-ILI3溶氧調節時上罐發酵的 生長和殘糖以及氨基酸產量Fig.4 Fermentation of strain Δalr-ILI3 with adjusted dissolved oxygen in 2 L fermenters

從圖4可以看出，在溶氧改變之后，菌株的生長速率相較于圖2的溶氧值恒定的菌株基本沒有變化，發酵結束時，OD562值為148.45，最終生物量也沒有提高。發酵96 h時，4-HIL產量達到269.20 mmol/L，相較于未優化前，4-HIL產量提高了11.2%。Ile產量在發酵終點有42.18 mmol/L，雖然還是有較多的Ile沒有轉化成4-HIL，但是根據4-HIL產量可以說明，溶氧值的提高有助于Ile向4-HIL的轉化。

2.2.3 菌株Δalr-ILI3補料改變對發酵生產4-HIL的影響

在上罐發酵過程中，之前的補料都是添加單一的葡萄糖濃縮液，為了進一步增加上罐發酵過程中菌株的活力，使用初始培養基中的葡萄糖、硫酸銨、玉米漿、磷酸二氫鉀、無水硫酸鎂、酵母粉、維生素B1、甜菜堿組成混合溶液，配成8倍濃縮液進行補料。發酵結果如圖5所示。

a-生長和殘糖；b-氨基酸產量圖5 菌株Δalr-ILI3補料調節時上罐發酵的生長和 殘糖以及氨基酸產量Fig.5 Fermentation of strain Δalr-ILI3 when changing feed supplement in 2 L fermenters

從圖5可以看出，在改變補料后，菌株的生物量總量有了增長，最大OD562值可達到167.3。發酵96 h時，4-HIL的產量可達到324.72 mmol/L，相較于未用該方法優化前，產量又提高了20.6%，相比于2.2.1產量則提高了34.1%，并且Ile的產量也有了提高。這也是目前報道的由葡萄糖從頭合成4-HIL的最高產量。根據4-HIL產量可以說明，在谷氨酸棒桿菌生產4-HIL的上罐過程中不僅僅補加葡萄糖溶液，也補加微生物發酵所需的其他成分可以增加4-HIL的產量，延長菌株的活力。

3 結論

本研究為了提高谷氨酸棒桿菌生產4-HIL的應用能力和發酵水平，首先在菌株SN01中敲除丙氨酸消旋酶編碼基因alr，并向敲除菌中轉入表達alr基因和ido基因的質粒進行回補，回補菌株Δalr/p4-ido在生長速率和糖耗方面和未敲除菌株基本相同，且在發酵時無需添加抗生素就可以維持質粒穩定存在和4-HIL合成，因此能夠代替抗生素作為篩選標記。其次結合菌株發酵特點，進行發酵罐上的發酵條件優化。當種子在種子培養基中生長到18 h，進行接種，這時種子活力最高，能夠生產4-HIL 242.18 mmol/L，Ile 47.33 mmol/L；在菌株OD562值超過50時將發酵罐的溶氧值由20%調節為30%，這時4-HIL的產量可以達到269.20 mmol/L。最后調整了補料方法，進行初始培養基濃縮液補料之后，4-HIL的產量達到了324.72 mmol/L，相比未優化前提高了34.1%。此前，實驗室TAN等通過對L-異亮氨酸生物傳感器Lrp-PbrnFE中的PbrnFE啟動子進行改造和篩選，利用不同的PbrnFE啟動子動態調控ido的表達，同時動態調節α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)和氧氣的供應，搖瓶上4-HIL產量達到最高，為(135.34±12.55) mmol/L[20]。張成林等[21]通過代謝工程改造增加了4-HIL原料的供應，同時通過動態調控來實現α-KG的動態供應，成功地改善了4-HIL的合成。最終菌株HIL18搖瓶水平4-HIL產量為42.13 mmol/L，7.5 L罐發酵4-HIL產量達到232.38 mmol/L。之后通過發酵優化使4-HIL的產量達到了263.27 mmol/L[19]。所以，本文章結果也是目前報道的谷氨酸棒桿菌發酵生產4-HIL的最高產量。該方法為提高4-HIL的合成效率提供了參考。