食用黃花菜SSR標記開發及指紋圖譜庫構建

劉新星，歐巧明，羅俊杰，李忠旺，石有太，崔文娟

(甘肅省農業科學院生物技術研究所，甘肅 蘭州，730070)

黃花菜俗稱“金針菜”,在植物分類學上屬百合科萱草屬(HemerocalissL.)植物[1]，是一種藥食同源的特色蔬菜，其花蕾可食用，具有豐富的營養價值，與香菇、木耳、冬筍并稱為“四大素山珍”[2]。據報道，黃花菜的揮發性成分多達58種[3-4]，含有大量的醇、酯等香氣物質，賦予黃花菜特有的美味。近年來有研究表明，食用黃花菜還有抗氧化、抑制纖維原細胞增生及阻止癌細胞生殖等作用[5]。

隨著分子生物學的發展，DNA 分子標記鑒定因快速準確、不受環境影響等優點逐漸發揮重要作用，滿足品種快速準確鑒定和指紋圖譜構建的要求[6-7]。其中SSR標記具有共顯性、高度重復性和豐富的多態性等優點，通過PCR快速檢測就能達到鑒定目的。目前基于SSR分子標記的玉米、大豆、小麥、油菜等主要農作物的指紋圖譜庫已構建完成[7-11]。關于黃花菜品種DNA指紋圖譜及分子標識研究，陳士林院士[12]針對藥用黃花菜開展過DNA條形碼分子鑒定研究。

在農業科技迅速發展和農產品市場競爭日趨劇烈的今天,真正的特色農產品優勢發揮離不開現代農業技術。食用黃花菜作為特色加工型農產品，利用現代農業技術快速發展優良種質、產地標識及分子身份證構建研究已迫在眉睫。本研究擬利用轉錄組測序技術開發黃花菜的SSR標記，構建黃花菜DNA指紋圖譜庫，預期研究結果為食用黃花菜種質資源鑒定、評價及遺傳多樣性分析提供技術，進一步為品種更新及產業扶貧提供科技支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試43份食用黃花菜種質資源由甘肅省農科院黃花菜種質資源圃提供，種質名稱及來源見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 EST-SSR引物設計與篩選

采用二代測序技術對黃花菜進行轉錄組測序，并使用MISA軟件對所有測序所得的轉錄本進行SSR位點搜索。搜索標準為：SSR重復最低長度為18 bp，單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復最低次數為12、6、5、5、4和4次，間隔不完全重復的SSR位點不列為搜索對象。結合SSR位點兩端保守的特點，利用Primer 3.0軟件進行批量引物設計，共設計引物11 363對，根據基因注釋分類，挑選出氨基酸代謝和萜類聚酮化合物代謝相關的Unigene中的SSR引物進行合成，共計89對。另從文獻中搜索得到25對萱草屬通用的SSR引物[13-14]，合計114對引物進行篩選鑒定。

表1 黃花菜種質名稱及來源Table 1 The names and original of Hemerocallis citrina

引物設計的原則為EST序列長度大于200 bp，SSR序列的開始和結束位置分別距5’和3’端不少于20 bp，引物長度18～24 bp，退火溫度Tm值40～60 ℃，上游和下游引物的Tm值相差不大于5 ℃，GC含量40%～60%，且上游和下游引物的GC含量相差不要太大，產物預期長度100～500 bp。對各條引物的最佳退火溫度進行試驗，以每條引物的解鏈溫度(Tm值)為參考，上下各浮動5 ℃，通過梯度PCR儀自動生成8個溫度梯度，以擴增條帶多且明亮、背景清晰者為最適溫度選擇。

1.2.2 樣品DNA提取

樣品由硅膠顆粒迅速干燥后帶回，每個樣品取約50 mg，球磨儀研磨后用天根的植物基因組DNA提取試劑盒進行樣品DNA的提取，提取完成后用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行樣品DNA質量的檢測，并用超微量分光光度計測定其濃度和純度，將DNA稀釋至20～50 ng/μL，4 ℃保存備用。

1.2.3 PCR擴增

PCR擴增體系總反應體積15 μL，包括2×Taq Master Mix 7.5 μL，DNase-Free Water 4.5 μL，Forward Primer 1 μL，Reverse Primer 1 μL，模板DNA 1 μL。反應程序：95 ℃熱啟動3 min，95 ℃變性45 s，48～65 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環后，72 ℃終延伸5 min后結束。

1.2.4 非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳與生物分析儀檢測

利用1.5%的瓊脂糖凝膠和6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進行引物的初篩和多態性篩選，待篩選出核心引物后，使用核心引物對所有供試材料進行PCR擴增，擴增產物稀釋10倍后上樣至LabChipGx Touch大分子生物分析儀進行自動化檢測，軟件自動收集電泳數據。

1.2.5 數據分析

利用Excel軟件統計分析數據，NTSYS軟件的UPGMA進行聚類分析。利用 PIC(polymorphism information content)評價引物多態性，PIC計算如公式(1)所示：

(1)

式中:Pij表示標記i的第j個等位基因在群體中的頻率[15]。

2 結果與分析

2.1 黃花菜轉錄組SSR位點分布頻率與基序特征

采用Illumina Hiseq技術，從黃花菜樣品中測序共得到104 177個Unigene，總長度為79 106 833 bp, 平均長度為759 bp，GC含量為41.99%。利用MISA軟件對Unigene進行搜索，共檢測到15 890個SSR，分布于12 492個Unigene，占總序列的11.99%，含有2個或2個以上SSR的Unigene有2 545個，復合SSR有1 316個，占總序列的8.28%。從黃花菜EST-SSR中基元分布頻率情況(表2)看，單核苷酸到六核苷酸基元類型均有分布，其中三核苷酸重復占比最高，為44.26%，二核苷酸和單核苷酸次之，分別為27.23%和18.57%，四、五、六核苷酸占比較低，不足5%。從重復次數看, 黃花菜轉錄組SSR重復基序的重復次數分布在4～115次, 其中4～8次的SSR個數占總數的69.93%;其次為9～12次的SSR, 共有2 095個, 占總數的13.18%;13次以上重復的有 2 699個，占16.99%(表2)。其中，單核苷酸重復次數以≥13次為主，占單核苷酸總重復次數的76.37%，二核苷酸重復次數主要以6～7次重復為主，占二核苷酸總重復次數的53.78%，三核苷酸重復中以5～6次重復為主，占三核苷酸總重復次數的72.64%。

從黃花菜基元類型分布圖(圖1)看，單核苷酸重復基元類型以(A/T)n為主，占單核苷酸重復總數的96.387%；二核苷酸重復基元類型以(AG/CT)n和(AT/AT)n為主，分別占比64.16%和26.25%；三核苷酸重復基元類型以(AAG/CTT)n和(AGG/CTT)n較多，占比分別為26.87%和15.23%，其余還有8種基元類型，占比從2.55%到10.93%均有分布；四、五、六核苷酸重復基元類型以(AAAT/ATTT)n、(AAAAT/ATTTT)n和(AACCCT/AGGGTT)n最多。

表2 黃花菜EST-SSR的分布頻率Table 2 The distribution of the SSR motifs in Hemerocalli scitrina

圖1 黃花菜EST-SSR基元類型分布Fig.1 The distribution of EST-SSR types in Hemerocallis citrina

2.2 EST-SSR核心引物篩選及多態性分析

以2份黃花菜種質(祁東白花菜和金蕾1號)為材料，采用PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳檢測，對114對SSR引物進行初步篩選，共選出擴增條帶清晰、目標條帶大小相一致的引物70對，有效引物比率為60.87%；選擇6份不同地方來源的黃花菜作為材料，利用6%非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳對70對初選引物進行多態性引物篩選，共篩選出條帶清晰、多態性高、擴增穩定的引物33對，多態性引物擴增率為26.09%；進一步選用供試43份黃花菜種質材料，對上述篩選出的33對引物進行PCR擴增、6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，最終篩選出20對品種類型間多態性高、條帶清晰易讀取的SSR引物作為黃花菜指紋圖譜構建的核心引物(表3)。20對引物中二核苷酸重復4對，三核苷酸重復13對，四、五、六核苷酸重復各占1對，重復次數主要以5～6次為主。

20對核心引物的PIC值變幅為0.23～0.77，平均為0.499 5。其中，引物HH42的PIC值最高，HH78的PIC值最低。20對核心引物中有12對引物為高度多態位點(PIC>0.50)，占比60%，7對引物為中度多態位點(0.25≤PIC≤0.50)，占比35%，1對引物為低度多態位點(PIC<0.25)，占比5%，表明篩選出的20對核心引物在參試品種間具有豐富的多態性。

2.3 指紋圖譜庫的構建

20對核心引物對43份黃花菜種質進行擴增檢測，統計各黃花菜種質在20個SSR位點上的擴增片段大小，用片段大小命名各等位變異，建立包含43份黃花菜種質的DNA指紋圖譜庫(表4)，篩選出安民花1號、祁東四月花、棒槌花、高箭中期花、雪不謝苗、祁東中期花、四川武平旱共7個黃花菜品種的特異標記。在20個位點中共檢測到88個等位變異，每個位點的等位變異數為3～8個，平均為4.4個。

2.4 聚類分析

根據NTSYS軟件genemic similiarity計算，43份黃花菜種質材料間的遺傳距離變化為0～0.813 8，遺傳相似度變化范圍為0.443 2～1，從聚類圖(圖2)中看出，其中有5組(I-V)材料，每組材料間相似度為1，組內無法區分，分別是：I組為渠縣花、山西大同花、未知2和未知4；II組為淮陽花、沙苑金針和浙江仙居花；III組為祁珍花和未知黃花型；IV組為猛子花、沐陽采集種質和金蕾1號；V組為重慶紅花和龍游紅花菜。除去以上14種種質資源，剩余的29份種質均可以進行區分，且以上5組材料組間仍然可以進行區分。

表3 20對EST-SSR引物信息Table 3 The primer information for 20 pairs of EST-SSR

圖2 43份黃花菜種質聚類圖Fig.2 The cluster analysis dendrogram of 43 varietiesin in Hemerocallis citrine

3 討論

種質資源是植物遺傳改良的物質基礎，然而，日益龐大的種質數量增加了資源收集保存和遺傳改良工作量，導致工作效率低下[15]。通過分子標記鑒定，篩選淘汰同名異物、同物異名的冗余種質，提高種質資源的鑒定保存效率。與其他分子標記相比，SSR 分子標記在基因組上分布均勻、數量豐富、穩定性好且技術成熟，可從DNA水平直接鑒定品種間遺傳差異[16]。國際植物新品種保護聯盟把SSR和SNP作為作物品種DNA 指紋庫構建的分子標記[17]，并已經在遺傳多樣性分析、品種鑒定、群體結構及圖譜構建等方面得到應用[18-20]。李益等[21]利用21對SSR核心引物，構建了包含500份柑橘品種的 DNA 指紋圖譜庫，篩選出部分品種的特異標記，可以鑒別221份柑橘品種和87個品種組合。分子標記在黃花菜上的應用十分滯后，主要有以下幾方面的進展：鄭家禎等[22]利用SCoT分子標記技術對28份國內栽培的黃花菜資源19個形態學特征進行了遺傳多樣性分析，李森等[23]對85份萱草屬植物開花表型性狀進行多樣性分析，黎海利等[24]借助 AFLP標記對35份萱草野生種和栽培品種進行親緣關系研究，但是這些研究很少結合形態學和分子標記進行比對分析，且未專門針對國內食用黃花菜的品種資源進行分析。

本研究所選的20對核心引物能將43份地方種質中的29份有效區分，未能區分開的品種有5組共14個。通過分析14個品種的親本、植物學性狀、來源等相關信息發現，這些品種的特征特性較為接近，例如“重慶紅花菜”和“龍游紅花菜”這一組，2個品種在開花期花朵顏色、大小、葉形等植物學性狀完全相同。“渠縣花、山西大同花、未知2和未知4”這組可能存在同一個品種在不同地方因品種名稱不一樣而被重復收集的情況，也就是同種異名的現象。由于黃花菜育苗仍以農民自己傳統育種為主，有些品種可能是在地方品種的基礎上提純復壯而來，兩者間的遺傳背景一致，因此利用有限數量的分子標記仍難以鑒別。

4 結論

本研究篩選出20對擴增穩定、條帶清晰、多態性高的核心引物，依據擴增產物的片段大小確定了每個SSR位點的等位變異以及對應的參照品種，建立了基于EST-SSR的DNA指紋鑒定技術體系，并構建了43份黃花菜種質的DNA指紋數據，可以應用于黃花菜種質鑒定和遺傳多樣性評價。

表4 黃花菜品種基因型數據Table 4 Genotype data of d Hemerocallis citrina

續表4

續表4