膜醭畢赤酵母菌外泌蛋白抑菌復合膜的制備及性能研究

楊昭輝，王笑笑，趙祺，閆晨卉，郭紅蓮

(天津科技大學 食品科學與工程學院，天津，300457)

酵母菌是人類文明史中被應用得最早的微生物，其中拮抗酵母菌在果蔬貯藏期病害防治領域被廣泛研究[1]。將拮抗微生物作用于病原菌雖然效果很好，但因其活體生長要求營養條件苛刻，很難直接作用于食品上并實現工業化生產。因此，從微生物和代謝物質中提取具有抑菌功能的物質成為新的研究方向。

已有研究表明，拮抗菌D.hansenii產生的低分子質量蛋白能夠抑制所有被測病原菌菌絲體的生長，從而延長果實的保藏時間和果品質量[2-3]。交鏈孢霉菌(Alternariaalternatasp.)是低溫環境下導致水果、蔬菜等農產品腐爛變質的主要致病微生物，是果蔬保鮮的重要防治對象[4]，作者所在實驗室分離得到1株膜醭畢赤酵母，對交鏈格孢菌有明顯的抑制作用[5]，對其抑菌成分的開發可為該菌工業化應用提供有力的保證。

本文對膜醭畢赤酵母發酵液進行初步抑菌性探索，在此基礎上，以玉米淀粉為基質，添加食品級卡拉膠共混，以甘油為增塑劑制備復合抑菌膜。探索粗提純蛋白的加入對復合膜力學性能、阻隔性能和外觀形態等的影響，并研究該復合膜對交鏈格孢菌生長的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

玉米淀粉、卡拉膠(食品級)，河南萬邦化工科技有限公司；甘油、硫酸銨(分析純)，天津市風船化學試劑科技有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶(分析純)，索萊寶科技有限公司。

1.2 供試菌和培養基

膜醭畢赤酵母菌(Pichiamembranaefaciens)、交鏈孢菌(Alternariaalternata)和灰葡萄孢霉(Botrytiscinerea)由天津科技大學農產品物流保鮮與加工研究室提供。

1.3 儀器與設備

TU-1810紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；TE32 TA.XT.plus質構儀，英國Stable Micro System公司；ZHJH-C1109B無菌操作臺，上海智城分析儀器制造有限公司；TGL-16M高速冷凍離心機，上海向帆儀器有限公司；CH1S測厚儀，上海六菱儀器廠。

1.4 膜醭畢赤酵母發酵液抑菌性研究

(1)膜醭畢赤酵母發酵液制備

將膜醭畢赤酵母接種于PDA液體培養基中，搖床培養3～5 d后，離心收集上清液，即為無細胞發酵液。

(2)發酵液對灰葡萄孢菌的離體抑制作用

參照余巧銀等[6]的方法，在27 ℃下，培養5 d，觀察發酵液對灰葡萄孢菌的離體抑制作用。觀察、計算抑菌率，如公式(1)所示：

(1)

(3)蛋白酶對發酵液抑菌活性的影響

將無細胞發酵液用1 mol/L的NaOH調節至pH為7后，分別加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K，使其終濃度為0.2 mol/L，在37 ℃水浴中充分反應4 h后，沸水浴加熱0.5 h，以同樣處理未接入蛋白酶的無細胞發酵液為對照組1；將無細胞發酵液用1 mol/L HCl調節至pH為2后加入胃蛋白酶，同樣以未接入蛋白酶的發酵液為對照組2。參照1.4(2)中的方法分別測定在添加不同蛋白酶處理發酵液的培養基中灰葡萄孢菌的生長直徑，以無菌水為對照組計算抑菌率。

1.5 生物蛋白抑菌復合膜的制備

(1)抑菌蛋白鹽析提取

在冷水浴下，將硫酸銨研磨后緩慢加入膜醭畢赤酵母發酵液中至硫酸銨的最終飽和度達到60%。冷藏過夜，離心收集蛋白質沉淀物，透析除鹽后冷凍干燥得到蛋白質提取物粉末。

(2)抑菌復合膜的制備

配制質量分數為6%的玉米淀粉溶液加熱糊化30 min[7]，同時配制質量分數為0.4%卡拉膠溶液，微波加熱[8]。將上述兩種溶液等體積混合后，向其中加入體積分數為1%的甘油制備成基礎膜液。

將凍干蛋白提取物粉末配制成10 mg/mL的溶液，隨后進行2倍梯度稀釋至16倍，將原液與各稀釋后的溶液分別按體積分數為1%加入基礎膜液中。

采用流延法[9-10]，取20 mL倒入直徑9 cm的一次性培養皿中，在45 ℃下恒溫干燥4 h后揭膜。將復合膜樣品存放于相對濕度(50±2)%環境中平衡48 h備用。

1.6 復合膜性質測定

1.6.1 厚度

參照張伸[11]的方法，測定復合膜的厚度。利用手持測厚儀(精確到0.001 mm)測定薄膜邊緣和中間10個點的厚度，取平均值。

1.6.2 力學性能

參照顏田田等[12]和肖力源等[13]的測定方法和計算公式，使用TA.XT.plus型質構儀測定復合膜的拉伸強度(tensile strength,TS)及斷裂伸長率(elongation at break,EAB)。

1.6.3 透濕性能

根據GB 1037—88《塑料薄膜和片材透水蒸氣性試驗方法杯式法》，參照陳紅艷等[14]的方法，水蒸氣透過系數(water vapor permeability,WVP)計算如公式(2)所示：

(2)

式中:Δm為稱量瓶增加的質量，g；d為復合膜的平均厚度，mm；A為稱量瓶瓶口面積，m2；t為稱量瓶放入恒濕器中的時間，24 h；Δp為23 ℃下的水蒸氣壓，KPa。

1.6.4 透明度

參照王海霞[15]的方法和計算公式，測定膜的吸光度值。計算復合膜透明度。

1.7 抑菌蛋白復合膜對交鏈格孢菌抑菌作用實驗

(1)平板對峙法：參照喬博鑫等[16]的方法，實驗組注入30 μL抑菌復合膜液，對照組注入30 μL無菌水。于28 ℃下培養5 d后觀察、記錄。

(2)含藥平板法[17]：將復合膜液與融化后的PDA培養基混合，待培養基凝固后，接入直徑為1 cm的交鏈格孢菌菌片，以無菌水組作為對照，于28 ℃下培養5 d后觀察、記錄。

1.8 數據統計分析

采用SPSS 19.0進行數據統計分析，數據用平均值±標準誤差表示，使用Origin 2017軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶對發酵液抑菌活性的影響

由圖1可知，胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶均能顯著降低發酵液的抑菌活性(P<0.05)，經過胃蛋白酶處理的發酵液的抑菌率僅為36.30%，而對照組為65.97%，但木瓜蛋白酶對發酵液的抑菌性影響不大。實驗證明，發酵液中存在蛋白類抑菌物質。

A-胰蛋白酶；B-木瓜蛋白酶；C-蛋白酶K；D-胃蛋白酶； CK1-對照組1；CK2-對照組2；CK-無菌水 a-不同蛋白酶處理后發酵液對灰葡萄孢菌生長的影響； b-不同蛋白酶處理后發酵液的抑菌率圖1 蛋白酶對發酵液抑菌性的影響Fig.1 Effect of protease on the antibacterial activity of fermentation broth注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 復合膜的性質

2.2.1 外觀形態

通過觀察外觀形態可以直接了解薄膜的顏色、透明程度及表面狀態。由圖2可看出，抑菌復合膜與基礎復合膜相比，顏色微黃，二者均較透明且表面平整光滑，無明顯的顆粒感和粗糙感。

a-基礎復合膜；b-抑菌蛋白膜圖2 玉米淀粉-卡拉膠基礎復合膜與抑菌蛋白膜外觀形態圖Fig.2 Appearance of corn starch-carrageenan basic composite film and bacteriostatic protein film

2.2.2 厚度和透濕性能

WVP是衡量包裝材料阻隔外界水氣接觸內部食品的重要指標。由表1可知，抑菌復合膜與基礎復合膜在厚度和WVP方面差異不顯著(P>0.05)，說明蛋白提取物的加入對復合膜的厚度和WVP無較大影響，抑菌復合膜薄厚均勻且有良好的水分保持作用。這可能是由于蛋白提取物與玉米淀粉、卡拉膠等基礎成膜材料具有良好的相容性[18]，抑菌復合膜質地連續均勻。

表1 抑菌復合膜與基礎復合膜厚度和WVP對比Table 1 Comparison of thickness and WVP between antibacterial composite membrane and basic composite membrane film

2.2.3 透明度和力學性能

透明度是衡量包裝材料性能的指標之一，良好的透明度便于觀察被包食品的外觀形態。由圖3可知，基礎復合膜透明度可達到(66.80±1.63)%，加入蛋白提取物原液的復合膜透明度僅有(52.09±1.32)%，下降了18.71%。此外，透明度隨著蛋白提取物濃度降低而上升，當稀釋倍數達到16時，抑菌復合膜的透明度升至(64.54±1.63)%，與基礎復合膜之間無明顯差異。這可能是由于蛋白提取物本身呈現黃色，加入后使膜也呈現黃色(如2.2.1所示)阻礙了光的傳播路徑。

圖3 不同濃度蛋白提取物對復合膜透明度的影響Fig.3 Effects of different concentrations of protein extracts on the transparency of composite membrane

力學性能反應了薄膜的柔韌性和抗拉強度，由圖4可知,蛋白提取物的加入使復合膜的TS下降，EAB上升?；A復合膜的TS為(11.86±0.50) N/mm2，抑菌復合膜的TS為(5.80±1.54) N/mm2，下降了51%。普通復合膜的EAB為(35.19±7.27)%，抑菌復合膜的EAB為(62.07±6.41)%，增長了43%。這可能是因為蛋白提取物與淀粉發生相互作用，使淀粉本身氫鍵作用降低[19]，導致復合膜抗拉強度降低，由脆性向柔性轉變。

圖4 抑菌蛋白復合膜和普通復合膜力學性能對比圖Fig.4 Comparison of mechanical properties between antibacterial protein composite membrane and ordinary composite membrane

2.2.4 抑菌膜對交鏈格孢菌的離體抑制作用

平板對峙法：如圖5所示，經過對峙實驗發現，在培養5 d后，在分界線上出現明顯的抑菌帶，菌落半徑在靠近左側小孔明顯一側小于垂直方向上，靠近小孔測的菌落半徑只有(1.8±0.1) cm，在垂直方向上菌落半徑為(3.8±0.1) cm，說明抑菌膜液對交鏈孢菌有明顯的抑制作用。

含藥平板法：如圖6所示，在培養5 d后，含藥平板菌落直徑明顯小于對照組，實驗組菌落直徑僅為(1.2±0.1) cm，而對照組菌落直徑為(6.5±0.1) cm，約是實驗組菌落直徑的5.4倍，說明抑菌復合膜液對交鏈孢菌有明顯的抑制作用。

a-空白對照;b-實驗組反面;c-實驗組正面圖5 抑菌蛋白膜液與交鏈孢菌平板對峙結果Fig.5 Results of confrontation between antibacterial protein film solution and Alternaria alternata plate

a-實驗組;b-對照組圖6 含抑菌復合膜液藥平板對交鏈孢菌抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of liquid drug plate containing antibacterial composite membrane on Alternaria alternata

3 結論

近年來，以拮抗酵母菌為基礎的果蔬采后病原微生物防治產品的研究開發取得了令人矚目的進展[19]，本實驗室已有的研究表明，膜醭畢赤酵母菌發酵液中可能存在蛋白類抑菌物質，尋找能夠維持抑菌成分生物活性的載體成為進一步的研究方向[20]。本文在此基礎上，進一步探索了以玉米淀粉-卡拉膠復合膜為基礎的膜醭畢赤酵母菌外泌蛋白抑菌復合膜。

經實驗測定發現，外泌蛋白提取物與成膜基質間有較好的相容性，添加蛋白提取物的抑菌復合膜與基礎復合膜相比，仍具有薄厚均一、平整致密和延緩水分散失的優點；力學性能和外觀形態對比發現，蛋白提取物的加入會使復合膜的顏色加深，透明度下降，由脆性向韌性轉變；經過抑菌作用分析，該抑菌復合膜對交鏈格孢菌菌絲生長有直接的抑制作用，能顯著抑制菌落的擴大。

膜醭畢赤酵母菌外泌蛋白抑菌復合膜是一種天然、安全包裝材料，為生物防治果蔬腐敗變質產品的開發提供了新思路。