基于頂空氣相色譜-離子遷移譜對蜂蜜中耐高滲酵母特性及其污染的早期檢測研究

王銀，劉彩玲，王賢，岳田利，曹煒

(西北大學 食品科學與工程學院，陜西 西安，710069)

蜂蜜滲透壓高、pH低且含有大量酚類抑菌物質，除耐高滲酵母外的大多數微生物均難以在其中生存[1]。耐高滲酵母污染早期較難發現，在污染中后期會引起蜂蜜風味及營養價值改變，導致產品嚴重腐敗，因此其污染不但會對企業造成經濟損失，也會嚴重影響進出口貿易[2-3]。國際食品法典委員會(Codex Alimentarius Commission, CAC)標準規定蜂蜜在貯存、銷售及運輸中不得發酵及發生風味改變，因此耐高滲酵母被列為需要控制的重要腐敗菌之一，近年來已被各國列為蜂蜜進出口檢驗的重要檢測指標[4-5]。

頂空氣相色譜-離子遷移譜聯用技術(headspace-gas chromatography-ion migration spectroscopy, HS-GC-IMS)根據氣相離子遷移速率差異對揮發性物質分離，并通過IMS檢測器進行組分分析[6]。該方法將氣相色譜的簡單便捷與離子遷移譜的高分辨率、高準確度有效結合[7]。目前國內外耐高滲酵母常用檢測方法中GC-MS、固相微萃取-氣質聯用及HPLC-MS法準確度高，但檢測對象主要為酵母發酵的次級代謝產物，往往檢出時產品已嚴重腐敗，氣相色譜-嗅聞-質譜(gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry,GC-O-MS)聯用電子傳感器較上述方法更加靈敏，但儀器對空氣濕度溫度敏感，檢測環境要求較高[4, 8]。HS-GC-IMS可以克服上述方法耗時長，成本高、檢測環境及人員要求高等缺點，以其準確、靈敏、快速、易操作等特點，在食品品質及安全快速檢測領域中顯示出巨大的發展潛力[9]。

本研究對采樣自2013—2017年3個省份的35個蜂蜜樣品耐高滲酵母污染進行分離純化，通過PCR序列分析及耐糖性生長曲線測定確定分離株種屬及特性。結合HS-GC-IMS技術探究耐高滲酵母在污染蜂蜜過程的氣味指紋圖譜變化，為拓寬HS-GC-IMS在食品加工過程中污染檢測應用提供一定的理論依據。同時為及時發現蜂蜜在貯存過程中耐高滲酵母潛在污染，控制蜂蜜腐敗變質，降低產業經濟損失具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂蜜樣品信息見表1；洋槐蜜、棗花蜜購自老蜂農；葡萄糖、蛋白胨、瓊脂粉、酵母浸粉，北京奧博星；rTaq酶，寶日醫生物技術(北京)有限公司；酵母DNA抽提試劑盒，Thermo Fisher Scientific公司；引物，奧科鼎盛生物公司。

1.2 儀器與設備

Infinite M200Pro酶標儀，瑞士TECAN；FlavourSpec?氣相離子遷移譜聯用儀，德國G.S.A公司；凝膠成像儀、電泳儀，美國Bio-Rad；SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；DHP-9162恒溫培養箱，上海齊欣科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蜂蜜樣品理化指標

蜂蜜樣品理化指標：pH、水分含量、葡萄糖含量、果糖含量、蔗糖含量測定依照SN/T 0852—2012《進出口蜂蜜檢驗規程》進行。

1.3.2 蜂蜜中耐高滲酵母分離純化

稱取2.0 g蜂蜜樣品，加入2 mL滅菌蒸餾水稀釋后涂布于YPD平板，重復3次，28 ℃培養2～4 d。

挑取疑似菌落劃線轉接于YPD平板，28 ℃培養2～4 d。重復2次，最后一次將菌落刮下與1.5 mLV(YPD)∶V(甘油)=1∶1混勻，凍存至-80 ℃備用。

1.3.3 26S rDNA鑒定

酵母菌轉接至YPD液體培養基中，30 ℃，150 r/min培養24 h。采用Yeast DNA Extraction Kit提取模板DNA。

采用酵母菌26S rDNA通用引物(NL1：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′；NL4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)。反應體系：引物各1 μL，Taq酶1 μL，dNTP 4 μL，10×Buffer 5 μL，模板5 μL，超純水補足50 μL。擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，36循環；72 ℃延伸5 min。擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。通過NCBI數據庫進行BLAST比對，確定種屬類型。

1.3.4 耐高滲酵母耐糖性測定

取50 μL菌液(OD600=0.2)分別接入150 μL的YPD對照培養基及400、500、600、700、800 g/L的YPD高糖液體培養基中，每組3個平行。28 ℃培養7 d，每隔24 h測定1次OD600值，數據以平均值±標準差計，并繪制生長曲線。

1.3.5 蜂蜜中耐高滲酵母人工污染及培養

以篩選2號菌株人工污染棗花蜜及洋槐蜜。菌株活化后收集菌體，用滅菌蒸餾水清洗2次，調整菌液終濃度約為1 000 CFU/mL。在12份20 mL棗花蜜及12份20 mL洋槐蜜樣品中各加入100 μL菌懸液，28 ℃培養，在3、7、15 d時各取出1組(3只)樣品凍存至-80 ℃待測。15 d后以未接種酵母的棗花蜜及洋槐蜜為對照，測定其揮發性物質指紋圖譜。

1.3.6 HS-GC-IMS測定

將1 mL待測樣品置于頂空瓶。頂空孵化溫度：80 ℃；孵化時間：15 min；孵化轉速：500 r/min；頂空進樣針溫度：85 ℃；進樣量：500 μL。色譜柱：FC-SE-54；色譜柱溫度：40 ℃；載氣：高純N2(純度>99.999%)；設置程序流速2.00 mL/min保持2 min，在20 min內線性增至100 mL/min。IMS條件：漂移管溫度：45 ℃；漂移氣：N2(純度>99.999%)；漂移氣流速：150 mL/min。

1.3.7 數據處理

采用Origin Pro 2021b軟件對蜂蜜采樣條件、理化性質及耐高滲酵母檢出率進行Pearson關聯分析[10]；耐糖性數據以平均值±標準偏差表示，采用Graph Pad Prism 8.0軟件進行數據處理及繪圖；揮發性成分采用GC-IMS Library Search 1.0.3軟件進行分析，通過LAV中Gallery插件構建氣味指紋圖譜。

2 結果與分析

2.1 蜂蜜理化指標及耐高滲酵母污染

35個蜂蜜樣品水分含量為(16.91±0.09)%～(20.82±0.20)%，中蜂百花蜜、蘋果蜜平均水分含量低于油菜蜜、荊條蜜和椴樹蜜。含糖量為62.01%～76.54%，其中油菜蜜、荊條蜜平均含糖量顯著高于其他4種蜂蜜。pH為3.45～4.48，椴樹蜜平均pH最高，中蜂百花蜜最低。共有7個樣品檢出耐高滲酵母(7/35)，平均污染率為20.0%。其中油菜蜜(4/12)、荊條蜜(1/3)、椴樹蜜(1/3)檢出率較高均為33.3%，中蜂百花蜜(0/15)和蘋果蜜(0/1)均未檢出，山棗蜜(1/1)檢出率為100%(表1)。

如圖1所示，關聯分析表明，耐高滲酵母檢出率與蜂蜜含水量呈極顯著正相關(P<0.01)，其次與蜂蜜種類和采樣年份顯著相關(P<0.05)，受采樣省份、總糖含量及pH影響較小。GAGLIO等[11]研究發現蜂蜜中水分含量增加會促進蜂蜜中耐高滲酵母的繁殖。雖然本研究中耐高滲酵母檢出率與蜂蜜品種也呈現顯著相關性，但進一步分析發現耐高滲酵母主要存在于水分含量相對較高的油菜蜜、荊條蜜和椴樹蜜中，在水分含量相對較低的蘋果蜜與中蜂百花蜜均未檢出，由此推測耐高滲酵母與蜂蜜種類的相關性主要還是受不同蜂蜜間水分含量差異影響。ECHEVERRIGARAY等[12]研究發現，雖然蜂種不同、蜜源植物不同會顯著影響蜂蜜中酵母污染率，但根本影響因素是不同蜂蜜含水量差異，這一結論與本研究結果一致。

表1 蜂蜜理化指標及耐高滲酵母污染Table 1 Physicochemical indexes and osmotolerant yeast detection in honeys

2.2 蜂蜜中耐高滲酵母分離及26S rDNA鑒定

本研究共分離出7株耐高滲酵母(表2)，均為接合酵母屬(Zygosaccharomyces)，其中魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)及蜂蜜接合酵母(Zygosaccharomycesmellis)各2株。蜂蜜中微生物主要來自蜜源植物、土壤、蜜蜂腸道、蜂巢等，可污染蜂蜜的酵母菌主要有接合酵母屬、漢遜酵母屬、釀酒酵母屬、假絲酵母屬、裂殖酵母屬和畢赤酵母屬等耐旱性酵母，其中最容易污染蜂蜜的為接合酵母屬[1]。ECHEVERRIGARAY等[12]發現巴西無刺蜂蜂蜜中接合酵母屬為主要污染物，這與本研究結果一致。

圖1 耐高滲酵母污染與蜂蜜特性關聯分析Fig.1 Correlation analysis among the osmotolerant yeasts detection and physicochemical indexes in honeys

表2 耐高滲酵母26S rDNA分型Table 2 26S rDNA identification of osmotolerant yeasts

2.3 耐高滲酵母耐糖性及生長曲線測定

如圖2所示，7株耐高滲酵母雖然在高糖作用下生長受到部分抑制，但均表現出較強的糖耐受性，在800 g/L糖質量濃度下均可生長繁殖。高于LIU等[13]從蜂蜜中分離出的蜂蜜接合酵母LGL-1的700 g/L糖耐量，大多數耐高滲酵母耐糖量在300～650 g/L，而蜂蜜中天然的高糖環境更適宜耐高滲酵母的自然篩選[14]。接合酵母屬可通過調節繁殖模式，合成甘油、海藻糖及相關氧化酶等方式提高對高糖環境的適應性[13]。本研究中魯氏結合酵母1、2對高糖培養基適應性最好，無高糖脅迫時，培養24 h進入對數期增長，48 h進入穩定期，隨著糖濃度增加，對數期略有延長，穩定期推后至72 h。菌株3、4同為接合酵母屬，適應性較1、2弱，培養48 h進入對數期，96 h進入穩定期，隨著糖濃度增高穩定期推后，部分菌株生長被顯著抑制。蜂蜜接合酵母5、6適應性較弱，適應期在2～3 d左右，對數期增長緩慢，隨著糖濃度增高生長速度變慢，高糖濃度下7 d培養仍未達到穩定期。由圖2可以看出，大部分菌株生長隨著糖濃度升高被逐步抑制，但菌株2、3在糖質量濃度達到600 g/L后，其生長速度隨著濃度提高反而逐漸提升。類似研究中也發現在某特定濃度下酵母會有生長速率大于低濃度組的情況[15]，但其機理仍需進一步探討。

a-菌株1；b-菌株2；c-菌株3；d-菌株4；e-菌株5；f-菌株6；g-菌株7圖2 耐高滲酵母在不同糖濃度下生長曲線Fig.2 Growth curves of osmotolerant yeasts in different glucose concentrations

2.4 蜂蜜耐高滲酵母污染的HS-GC-IMS早期檢測

結合HS-GC-IMS內置NIST數據庫，根據保留時間、保留指數以及漂移時間對棗花蜜及洋槐蜜在耐高滲酵母污染前后不同時間段的揮發性成分進行定性分析(表3)。棗花蜜中共定性出54種風味物質，其中醛類15種，醇類11種，酮類10種，酯類8種，酸類5種，雜環類5種，有5種化合物在未污染蜂蜜中并未檢出[環己酮(36)、糠醛單體(22)、糠醛二聚體(32)、苯甲醛二聚體(35)、乙酸丁酯二聚體(23)]，其相對豐度在耐高滲酵母污染3 d后逐漸增加。洋槐蜜中共定性出35種風味物質，其中醛類10種，酮類8種，醇類6種，酯類7種，雜環類3種，酸類1種，僅環己酮(36)在未污染的洋槐蜜中未檢出，其相對豐度在耐高滲酵母污染3 d后逐漸增加。研究表明，蜂蜜中揮發性風味物質以醛、酮類為主，其次為醇類和酯類，其中棗花蜜風味物質種類較洋槐蜜更為豐富，研究結果與GU等[9]一致。

利用Gallery Plot插件構建棗花蜜和洋槐蜜在耐高滲酵母污染后隨時間推移的揮發性香氣物質指紋圖譜，比較揮發性組分在酵母污染早期的相對豐度差異(圖3)。在洋槐蜜和棗花蜜中，環己酮(36)、糠醛單體(22)、糠醛二聚體(32)、苯甲醛單體(33)、苯甲醛二聚體(35)及乙酸丁酯二聚體(23)的相對豐度均隨耐高滲酵母污染時間的延長而增加，其中環己酮(36)在2種蜂蜜對照組均未檢出，在培養3 d后開始出現，其相對豐度隨時間延長逐漸增高。環己酮是中蜂蜂蜜代表香氣成分之一[16]。意蜂蜂蜜發酵后會產生環己酮，因此耐高滲酵母污染會影響基于氣味指紋圖譜對蜂蜜分型的準確性。2種蜂蜜中苯甲醛單體(33)及苯甲醛二聚體(35)的相對豐度在耐高滲酵母污染3 d后顯著增加(圖3-b)。GAGLIO等[11]發現蜂蜜副產物經耐高滲酵母發酵后，苯甲醛及糠醛含量均顯著升高，這與本研究結果一致，推測苯甲醛可能為酵母發酵特征產物之一。棗花蜜中糠醛單體在耐高滲酵母污染后3 d檢出，糠醛二聚體在培養15 d后檢出(圖3-b)。洋槐蜜中糠醛單體及糠醛二聚體相對豐度也在酵母污染15 d時顯著增加(圖3-a)。糠醛為酵母發酵的重要代謝產物，也是衡量蜂蜜加工及貯藏品質的重要指標之一。蜂蜜中糠醛的來源有2種:(1)蜂蜜在熱加工中焦糖化反應生成；(2)與微生物對蜂蜜中抗壞血酸的降解和對C6～C9小分子醛的轉化有關。本研究中2種蜂蜜在被酵母菌污染后，均為糠醛單體相對豐度先增加，隨后糠醛二聚體再逐漸生成并增加，因此推測本研究中糠醛及其二聚體相對豐度的變化主要與耐高滲酵母發酵有關。除此之外，棗花蜜在耐高滲酵母污染后，乙酸丁酯(單體及二聚體)、苯乙醛、反式-2-辛烯醛、反式-2-己烯醇及2,3,5-三甲基吡嗪等呈香物質相對豐度也略有增加。

續表3

a-洋槐蜜；b-棗花蜜圖3 洋槐蜜及棗花蜜在耐高滲酵母污染3、7、15 d的氣相離子遷移指紋譜圖Fig.3 GC-IMS fingerprint maps of acacia honey and jujube honey contaminated by osmotolerant yeast in 3, 7, 15 days注：紅色框標注為相對豐度上升的化合物，綠色框標注為相對豐度降低的化合物；Y1～Y3、Y13～Y15為對照組，Y4～Y6、Y16～Y18為污染3 d組， Y7～Y9、Y19～Y21為污染7 d組，Y10～Y12、Y22～Y24為污染15 d組

洋槐蜜共有6種揮發性香氣成分相對豐度隨污染時間增加而降低，除苯甲酸甲酯(29)在第3天就有明顯降低外，苯乙酮(28)、乙酸乙酯單體(25)、乙酸乙酯二聚體(27)、葉醇(26)及2-庚酮(31)在污染初期相對豐度變化均較為緩慢，第7天開始顯著下降(圖3-a)。乙酸乙酯單體及乙酸乙酯二聚體具有明顯的花果香氣，是蜂蜜中較為常見的香氣成分，其主要來自于蜜源植物及蜂蜜加工過程中的焦糖化反應，洋槐蜜在酵母污染后該香氣成分相對豐度明顯降低，但棗花蜜中該成分略有上升，該差異可能由不同蜂蜜間香氣前體成分差異有關。棗花蜜中12種揮發性香氣成分的相對豐度從污染第3天起開始降低，其中2-己酮二聚體(14)、癸醛(13)、正戊酸(12)、3-辛醇(11)、丁酸丁酯(10)、仲辛酮(9)、正己醇(8)及庚醛二聚體(4)、正辛醛(3)為棗花蜜特有香氣成分(圖3-b)。2-戊酮(7)具有明顯的蘋果及花香氣味，賦予棗花蜜良好的香氣品質，庚醛二聚體(4)具有脂類香氣，是意蜂蜂蜜區別于中蜂蜂蜜的特征香氣組分[16-17]。2-庚酮(31)是唯一1種同時存在于棗花蜜和洋槐蜜中，且相對豐度隨污染時間增加而顯著降低的香氣成分，具有明顯的蘋果及花香氣味，是新鮮蜂蜜中最常見的揮發性香氣成分之一[6,18]。本研究中2-庚酮相對豐度在酵母污染后第3天顯著降低，15 d后在2種蜂蜜中均無檢出。有研究表明，2-庚酮的含量與氨基酸變化呈明顯的負相關[19]，酵母菌可將蜂蜜中的蛋白質分解為氨基酸作為氮源使用，發酵過程中氨基酸含量呈現先增加后降低的趨勢。因此在酵母菌發酵早期，隨著氨基酸含量迅速增加，其含量則會減少，這與本研究結果一致。由此推測2-庚酮相對豐度降低是由耐高滲酵母發酵引起，并可將其作為判斷蜂蜜中耐高滲酵母早期污染潛在代表組分之一。

3 結論

本研究對35份蜂蜜樣品中的耐高滲酵母進行分離純化、26S rDNA、耐糖性及生長曲線測定。理化性質關聯分析表明，耐高滲酵母污染率與蜂蜜含水量呈極顯著正相關(P<0.01)。共分離出7株耐高滲酵母菌，均為接合酵母屬，且具有較強的糖耐受性，在800 g/L糖質量濃度下均可生長繁殖。通過HS-GC-IMS對棗花蜜和洋槐蜜分別定性出54及35種揮發性香氣組分，以醛、酮類為主，其次為醇類和酯類，其中棗花蜜揮發性香氣組分種類較洋槐蜜更為豐富。HS-GC-IMS對耐高滲酵母污染后蜂蜜中揮發性香氣組分變化具有靈敏的檢測特性，糠醛單體、糠醛二聚體、苯甲醛單體、苯甲醛二聚體、環己酮及2-庚酮相對豐度變化可作為判斷棗花蜜及洋槐蜜在耐高滲酵母早期污染(3～7 d)的潛在特征香氣組分，但不同酵母菌發酵是否有差異仍需進一步探究。該研究為基于HS-GC-IMS技術對蜂蜜產業中耐高滲酵母污染的早期、快速、便捷檢測新方法的探索提供了理論依據。