蛋白質與配體相互作用機制研究方法進展*

王 茗，李紅霞

(華北理工大學化學與工程學院，河北 唐山 063200)

蛋白質是構成人體組織和器官的重要物質，人們對于蛋白質的研究從未停止。近年來，關于蛋白質-配體間的研究層出不窮，研究方法也不斷進步，對于蛋白質的相關研究做出了重大貢獻。在討論蛋白質-配體間作用機制中，光譜法比較常見，且應用廣泛，例如：熒光光譜、紫外-可見吸收光譜、圓二色光譜等。同時，等溫滴定量熱技術也逐漸被應用于這一領域，該技術可以在單個試驗中獲取蛋白質與配體間結合的結合常數(Ka)、結合位點數(n)以及熱力學常數，進一步分析得到作用力類型。分子對接是一種預測蛋白質與配體結合的各種可能的結合構象的技術，根據各個構象和和能量的匹配排名打分，選取最穩定的結合構象。分子對接的出現，對于許多配體-靶標的預測十分重要，對于藥物小分子的開發起到了推動作用。

目前，對于蛋白質與小分子作用的光學變化的研究已十分詳細，分子對接在藥物研發領域的應用十分廣發，但對于以溶液狀態存在的蛋白質與小分子間的作用機制卻沒有詳盡的綜述，所以，本文綜述了用于檢測溶液中蛋白質與配體相互作用的方法，以方便他人進行研究。

1 光譜法原理及其應用

1.1 熒光光譜法原理

熒光光譜是討論蛋白質-配體間相互作用的常用方法，通過分析蛋白質-配體體系的發射光譜的數據，可以對反應體系進行熱力學分析。小分子配體會對蛋白質的本源熒光產生猝滅作用，這種猝滅作用分為兩種，一種是碰撞所致的熒光猝滅，這種猝滅被叫做動態熒光猝滅，另一種是生成基態絡合物引發的熒光猝滅，這被稱為靜態猝滅，另外，還有一種產生碰撞的同時生成絡合物的過程，被叫做混合猝滅機制[1]。

1.1.1 猝滅機制

猝滅機制的判斷需利用Stern-Volmer方程[2]對數據進行分析，若計算所得KSV值與溫度的變化趨勢相反，則說明配體與蛋白質間是靜態猝滅，并生成了復合物，這是因為升溫不利于復合物的穩定性；反之，Ksv值與溫度的變化趨勢相同，則表明配體與蛋白質之間僅產生了碰撞，這是升溫導致碰撞增加所致[3]。此外，若Kq值大于生物大分子與猝滅劑碰撞可達的最大速率常數2×1010L·mol-1·s-1，則說明結合過程中僅存在靜態猝滅[4]。

(1)

1.1.2 結合常數和結合位點數

若蛋白質與配體間形成了新的復合物，即配體對蛋白質是靜態猝滅，則需要利用雙對數方程[5]繪制雙對數曲線，得到反應過程中配體和蛋白質之間的結合常數Ka和結合位點數n的值：

(2)

1.1.3 作用力類型

通過Van’t Hoff方程[6]和熱力學方程(4)進一步對數據進行分析，可以得到蛋白質與配體間作用的熱力學常數：焓變(ΔH0)、熵變(ΔS0)和吉布斯自由能變(ΔG0)。

(3)

ΔG0=ΔH0-TΔS0

(4)

按照ROSS等[7]的分析方法對熱力學數據進行分析，即可得到每個絡合作用的作用力類型以及驅動力類型。按照ROSS等的研究可知：對于所有相互作用，ΔH0和ΔS0均大于零表明，在反應中起主要作用的是疏水相互作用；ΔH0>0且ΔS0>0表明，氫鍵或范德華力在相互作用中的作用最明顯；ΔH0<0且ΔS0>0表明，靜電作用在結合過程中的作用最明顯；ΔS0為正值時表明，疏水作用和靜電作用在結合過程中的作用最明顯；ΔS0<0表明，氫鍵和范德華力在結合過程中的作用最顯著；當ΔH0接近零或很小的時候，主要起作用的是氫鍵。

1.2 同步熒光和三維熒光法原理

同步熒光和三維熒光光譜常被用來分析蛋白質在反應前后構型是否發生變化的常用手段。其中，將發射波長與激發波長的波長差分別為15 nm和60 nm時，其反映的是蛋白質中酪氨酸和色氨酸周圍的結構信息[8]，若是峰位置向長波方向移動，這說明氨基酸殘基的極性變強，肽鏈更加伸展；若是向短波方向移動，這說明氨基酸殘基的疏水性增強，肽鏈更加緊湊[9]。三維熒光可以同時反映激發波長、發射波長和熒光強度的變化，故而其反映的信息更加全面，通過蛋白質三維熒光光譜的變化，可以同時了解到蛋白質肽鏈和酪氨酸、色氨酸殘基的變化[10]。

1.3 紫外-可見吸收光譜法原理

紫外-可見吸收光譜是分析蛋白質-配體相互作用的重要手段之一。蛋白質的紫外吸收光譜中含有兩個吸收峰，從220 nm附近的強吸收峰的變化中可以得到蛋白質肽骨架是否發生變化的信息，分析280 nm附近弱吸收峰的改變能夠得到芳香族氨基酸是否受到配體絡合的影響[10]。如果反應前后蛋白質的譜圖發生了變化，則說明蛋白質與配體間形成了新的復合物[11]，若峰位置出現了變化，則表明蛋白質構象也發生了變化[12]。

1.4 圓二色光譜法原理

圓二色技術常被用來討論蛋白質二級構象的變化。若圓二色光譜中在208～220 nm之間存在兩個負峰，且這兩個峰呈現出“W”形，則表明是α螺旋結構；若217～220 nm間僅存在一個負峰，且這個峰呈現出“V”形則表明是β折疊結構[13-14]。

1.5 光譜法的應用

由于蛋白質的結構異常復雜，所以一種研究方法往往并不能很好地闡述蛋白質-配體間的作用機制，故而在實際操作中，常常結合上述幾種方法進行討論。張彥青等[15]利用光譜法和分子對接技術對赤蘚紅與溶菌酶之間的作用進行了研究。光譜法的結果表明：赤蘚紅對溶菌酶時靜態猝滅，并且以摩爾比1:1的比例形成了新的復合物。對熒光光譜的數據進行熱力學分析后，得出了在結合過程中疏水作用力和氫鍵使反應得以發生的結論。分子對接的結果與上述研究一致。王軍等[16]采用熒光光譜法、同步熒光光譜法、三維熒光光譜法、紫外光譜法以及分子對接法研究了檸檬黃與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。熒光光譜的結果顯示，檸檬黃對BSA是靜態猝滅，且1個檸檬黃結合到1個BSA上，且結合能力很強。熱力學分析表明，結合過程可自發進行，氫鍵或范德華力其主要作用。同步熒光和三維熒光的結果指出檸檬黃的加入，改變了BSA的構象，紫外-可見吸收光譜證實了BSA的變化。分子對接結果佐證了光譜法的結果。鄢雨中等[17]利用上述多光譜法結合分子對接技術對芹菜素與大豆分離蛋白之間的相互作用進行了研究。熒光的分析結果表明API對SPI是靜態猝滅，氫鍵或范德華力是相互作用過程中的主要作用力，反應過程自發且放熱。同步熒光表明，API的絡合，影響了SPI中的Tyr殘基和Trp殘基周圍的極性，其中Tyr殘基親水性變弱，極性減小，相反，Trp殘基的親水性變強，極性增大。三維熒光光譜和圓二色光譜實驗表明，API的加入，同時影響了SPI的多肽鏈結構，其結構較之反應前更加松散，不再緊湊，這也導致SPI表面的親水性變得更強了。分子對接的結果驗證了光譜法的結果。王曉霞等[18]模擬了生理環境，使用上述光譜法和分子對接法對黃腐殖酸(FA)和牛血清白蛋白(BSA)間的相互作用。熒光光譜的結果顯示FA對BSA是靜態猝滅，且一個FA剛好與1個BSA結合，二者之間的反應可以自發進行，主要存在氫鍵或范德華力，FA與BSA間存在非輻射能量轉移。紫外-可見吸收光譜中出現了最大吸收峰的峰位值向長波長方向移動的現象，說明FA的絡合影響了BAS的結構；同步熒光的結果又指出FA的加入對BSA中Trp殘基產生了影響，導致其變得比之前更加親水；三維熒光中兩個峰的最大發射波長都出現了不同程度的紅移，這表明FA的絡合改變了BSA表面的極性，其比之前變得更加親水了。從這幾種光譜的變化得出了FA的絡合影響了BSA的構象的結論。圓二色研究和分子對接結果更證明了FA的加入，使BSA中的結構發生了顯著變化，其中減少的結構有：α-螺旋結構和無規則結構，分別減少了2.3%和1.2%；增加的結構有β-折疊和β-轉角，分別增加了7.7%和0.6%，β-折疊結構含量增加的變化最顯著，這一結果強有力地證明了FA使BSA結構發生了改變。

2 等溫滴定量熱技術原理及其應用

2.1 等溫滴定量熱技術原理

圖1 等溫滴定量熱原理示意圖[19]Fig.1 Schematic diagram of isothermal titration calorimetry[19]

等溫量熱技術(Isothermal Titration Calorimetry，ITC)是目前唯一可以完整、準確地記錄整個反應過程中的熱量變化的手段。比起上述光譜法的研究，其結論可信度更高。等溫滴定量熱技術是將每一滴配體滴定進樣品池時產生的熱量波動轉化為一種維持樣品池和參比池溫度一樣所需的功率量(μcal/s)的形式呈現，這一過程中會將實驗過程中出現的熱量變化完整地記錄下來，再對熱量曲線進行積分，即可得到反應的結合常數、結合位點數和相應的熱力學數據。同樣利用Ross等[7]的方法對熱力學常數進行分析，即可得到蛋白質-配體間的作用力類型。

2.2 等溫滴定量熱技術的應用

肖語涵等[20]利用ITC技術和熒光光譜法對碲化鎘量子點(CdTe QDs)與轉鐵蛋白(transferrin，Tf)的相互作用進行了研究。熒光光譜的結果表明，CdTe QDs與Tf間存在靜態猝滅，二者間的結合位點數為0.3，與Tf結合后CdTe QDs的熒光強度增加了。熱力學分析的結果顯示，二者間可以自發地進行弱結合，同時放出熱量，氫鍵、靜電相互作用是這一焓-熵補償驅動過程的主要推動力，與Tf絡合后，CdTe QDs的化學穩定性增強了。智東明等[21]利用ITC對合成的一系列C3H12截短及全長蛋白質與一些潛在的RNA底物ARE9、ARE19及對照Random21結合過程的互作核心區域和熱力學性質進行了研究，并以熒光光譜和型熱泳動(microscale thermophoresis，MST)技術對ITC的結果驗證證。結果顯示，C3H12與ARE底物間以1:1的結合比進行結合，過程是自發的，是焓驅動為主的特異性結合。C3H12與ARE19間結和力約為ARE9的兩倍。C3H12中ZnF1-3是與ARE類底物結合的活性結構，并且主導了作用的發生。C3H12中的氨基酸殘基并未直接與ARE底物直接相互作用。

3 分子對接原理及其應用

3.1 分子對接原理

在蛋白質-配體間的作用研究中，分子對接可以直接將反應過程中的結合位點、結合位點處配體的構象、整個反應中起作用的作用力、氫鍵是否產生及氫鍵鍵長等信息。分子對接技術在藥物研發過程中常被用來篩選可以與靶點結合的先導藥物[22]，同時在蛋白質-配體的研究中也作為輔助工具，對結合反應的結論進行理論上的驗證和補充。

3.2 分子對接的應用

馬崢玲等[23]利用分子對接技術探討了加減薯蕷丸治療阿爾茨海默病(AD)的藥理作用與分子機制。模擬結果表明加減薯蕷丸可能通過減輕炎性反應、抗氧化應激、調節突觸可塑性、調控細胞凋亡等多種途徑發揮預防及延緩AD進展的效果。唐琳等[24]在模擬生理環境下利用分子對接技術、動力學模擬和光譜法對己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)與CYP3A4酶的作用機制進行了討論。熒光光譜表明DES與CYP3A4間存在靜態猝滅，紅外光譜和紫外-可見吸收光譜顯示，DES與CYP3A4的結合，對CYP3A4的內部環境和構象均產生了影響。分子對接和動力學模擬方法從理論上模擬了CYP3A4與DES相互作用后的構象變化情況，理論模擬與實際實驗結果互為印證。

4 結 語

與蛋白質相關的研究一直以來備受關注，其中蛋白質與配體間的結合機制更是各領域的熱點問題，尤其是在醫藥領域和食品領域。相關研究方法也一致在進步，而單一的研究方法往往具有局限性，可能會導致結論的可信度不高，而采取幾種研究方法相互驗證的方式來進行討論，往往更為大眾所接受。在研究以溶液狀態存在的蛋白質與配體結合的過程中光譜法、等溫滴定量熱法和分子對接技術的聯合使用，不失為一種好的選擇。