雙價抗蟲節(jié)水抗旱稻新材料旱恢3CA的創(chuàng)制

葉水烽 高寧寧 陳魅瑤 曾海云 馬國華

(1 上饒師范學院生命科學學院，江西 上饒 334001；2 溫州科技職業(yè)學院(溫州市農業(yè)科學研究院) 浙南作物育種重點實驗室，浙江 溫州 325006；3 上海市農業(yè)生物基因中心，上海 201106)

水稻(Oryzasativa)是全世界最重要的糧食作物之一，為快速增長的人口提供了近一半的主糧[1]。矮稈品種的培育和雜種優(yōu)勢的利用是水稻育種史上的兩次大跨越，為我國糧食生產做出了巨大貢獻[2]。長期以來，追求高產是我國農業(yè)生產的首要任務，然而，以提高單位產量為目的的“高投入、高產出、高污染”生產模式對資源的需求巨大，不利于農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。2005年，我國科學家提出了“綠色超級稻”構想和育種目標：少打農藥、少施化肥、節(jié)水抗旱、優(yōu)質高產[3-4]。結合水稻種質資源研究、功能基因組研究和分子輔助育種技術，科學家們培育出一系列綠色超級稻新品種，實現(xiàn)了資源節(jié)約型、環(huán)境友好型農業(yè)生產的轉型[5]。

水稻在生長過程中需水量大，尤其在生育后期，缺水會導致減產乃至絕收[6]，因此培育節(jié)水抗旱的水稻品種十分緊迫。節(jié)水抗旱稻是指結合了水稻的高產優(yōu)質和旱稻的節(jié)水抗旱特性的新栽培稻品種類型[7-8]。在灌溉條件下，節(jié)水抗旱稻的產量、米質與水稻基本持平，但對灌溉用水的需求不到水稻的一半；在缺乏灌溉條件的中低產田種植節(jié)水抗旱稻，可實現(xiàn)旱直播旱管、增產穩(wěn)產[9-11]。

除了受干旱影響，水稻生長中還經常遭受蟲害的侵襲，其中鱗翅目害蟲每年給我國農業(yè)造成高達近百億元的經濟損失[12]。為了培育抗蟲水稻，科學家們對包括野生稻和栽培稻的水稻種質資源進行了篩選鑒定，目前已定位和克隆出水稻抗褐飛虱基因，并培育出了抗褐飛虱水稻品種[13]。然而目前，在水稻及其近緣種中還沒有發(fā)現(xiàn)二化螟、三化螟、稻縱卷葉螟等鱗翅目害蟲的抗性種質資源，因此無法通過常規(guī)育種及分子標記輔助選擇技術等方式來培育抗蟲水稻新品種[14]。通過轉基因育種的手段增強水稻自身的抗蟲性，是解決上述問題的有效途徑。目前應用最廣的方法是將源于蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)的Bt基因轉入水稻，以培育抗蟲品種，使用較多的Bt基因主要有cry1Ab/Ac[15]、cry1Ab[16]、cry1Ac[17]、cry2AX1[18]等。通過密碼子優(yōu)化，華中農業(yè)大學林擁軍教授課題組獲得了具有自主知識產權的能顯著提高轉基因水稻抗蟲性的抗蟲基因cry2A[19]和cry1C*[20-22]。

隨著Bt制劑或轉Bt基因作物的廣泛使用，害蟲在持續(xù)的高壓下會對Bt蛋白產生抗性，因此，延緩害蟲抗性發(fā)展是未來轉Bt基因作物商業(yè)化的重要課題，而利用多基因聚合策略是目前延緩害蟲對Bt蛋白產生抗性的重要手段[23]。美國、澳大利亞、印度等國家主要種植含有cry1Ab/cry1Ac+cry1F、cry1Ac+cry2Ab等雙價抗蟲基因的轉基因棉花品種[24-26]。在水稻研究中，1999年第一例雙價的Bt(cry1Ac+cry2A)水稻誕生[27]，我國科學家又陸續(xù)創(chuàng)制了一系列雙價抗蟲轉基因水稻新材料，為轉Bt基因抗蟲水稻提供了技術和材料保障[28-29]。

本研究利用華中農大轉基因明恢63(T1C-19)和轉基因明恢63(T2A-1)兩個已經通過環(huán)境釋放的成熟轉基因水稻材料為Bt基因供體，與節(jié)水抗旱稻恢復系旱恢3號雜交，經過多次回交和自交，通過大田農藝性狀考察和自然條件抗性鑒定，獲得高抗螟蟲的新恢復系旱恢3CA，以期為后續(xù)雜交選育既節(jié)水抗旱又高抗螟蟲的新品種奠定材料基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

cry1C*、cry2A基因供體材料分別為轉基因明恢63(T1C-19)和轉基因明恢63(T2A-1)水稻品種，由華中農業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室林擁軍教授提供。節(jié)水抗旱稻恢復系品種旱恢3號由上海市農業(yè)生物基因中心提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 旱恢3CA的選育 以明恢63(T1C-19)和明恢63(T2A-1)為cry1C*基因、cry2A基因供體，分別與節(jié)水抗旱稻恢復系旱恢3號雜交，田間噴施草丁膦(Basta)進行抗性篩選，并進行PCR和蛋白檢測篩選陽性植株，回交3代后自交1代獲得分別攜有cry1C*和cry2A基因的純合旱恢3號，而后進行雙Bt基因聚合雜交，回交3代后自交4次獲得純合的雙價純合抗蟲材料，命名為旱恢3CA，每世代進行取樣，并進行cry1C*基因和cry2A的PCR檢測及田間噴施Basta抗性篩選。具體選育流程見圖1。

圖1 旱恢3CA恢復系的選育流程Fig.1 Breeding of restore line Hanhui 3CA

1.2.2 田間Basta抗性篩選 分蘗初期，配制終濃度為0.3%的Basta直接在田間噴施轉育水稻植株，葉片變黃甚至死亡的為陰性植株，不受影響的為陽性植株。

1.2.3 轉育植株的PCR鑒定 利用CTAB法提取水稻基因組DNA作為擴增模板。根據(jù)cry1C*和cry2A基因的序列信息設計引物，引物序列信息見表1。PCR反應體系為20 μL：DNA 模板30～50 ng，10× buffer 2.0 μL，2 mmol·L-1dNTP 1.0 μL，25 mmol·L-1MgCl21.0 μL，10 μmol·L-1引物(F/R)各0.2 μL，Taq酶1個單位，加滅菌ddH2O至20 μL。PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，57℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃終延伸10 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳后置于凝膠成像系統(tǒng)下觀察條帶。

表1 Bt 基因的引物序列信息Table 1 Primer sequence of Bt genes

1.2.4 Cry1C*和Cry2A蛋白的定性和定量檢測 Bt蛋白的定性檢測采用武漢上成生物科技有限公司的Cry1C和Cry2A膠體金試紙條。取分蘗期新鮮葉片，加緩沖液碾磨出汁，取500 μL碾磨液置于1.5 mL離心管，將膠體金試紙條插入液體中，3～5 min后讀取結果，有質控線和檢測線雙條線即為陽性植株。Bt蛋白的定量測定采用EnvironLogix公司(美國)的ELISA檢測試劑盒(QualiplateTMkit for Cry1Ab/Cry1Ac)，樣品的制備、酶聯(lián)免疫反應及OD值的測定，均嚴格按照試劑盒的使用說明書進行。

1.2.5 農藝性狀考察 在正常大田水肥、防治螟蟲(打藥)管理下，每個小區(qū)各種植6行旱恢3CA和旱恢3號，每行8株，共48個單株，3次重復，每個重復隨機取10個單株，對株高、單株有效穗數(shù)、穗長、每穗粒數(shù)、結實率、千粒重及單株產量等農藝性狀進行考察。

1.2.6 田間自然條件下的抗蟲性鑒定 在上海市青浦區(qū)白鶴鎮(zhèn)、海南省陵水縣光坡鎮(zhèn)上海市農業(yè)科學院轉基因基地內，種植旱恢3CA和旱恢3號水稻，進行除防治螟蟲外的正常水肥及病蟲害管理，觀察植株的卷葉和白穗情況。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用t測驗法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 雜交選育過程的Basta抗性和PCR陽性檢測

因T1C-19和T2A-1均含有bar基因，因此，在選育過程中，對水稻植株噴施0.3%的Basta。含有cry1C*或cry2A的雜交后代會表現(xiàn)出Basta抗性，生長不受影響；而不含外源bar基因的植株會發(fā)黃直至死亡(圖2-A)。 對存活的植株進行PCR檢測，只有同時含有cry1C*和cry2A兩個基因的后代，電泳檢測結果才會同時含有799和600 bp 2條目標帶，含單基因的植株則只能擴增出799或600 bp的1條帶(圖2-B)。

2.2 雜交選育過程的Cry1C*和Cry2A蛋白定性檢測

根據(jù)PCR檢測結果，對同時含有cry1C*和cry2A基因的轉育植株進行Bt蛋白定性檢測，陰性植株只顯示1條質控線，陽性植株同時顯示質控線和檢測線(圖3)，每一代保留Cry1C*和Cry2A蛋白雙陽性植株進行回交及自交。

注：左為陰性植株，只顯示質控線；右為陽性植株，質控線和檢測線均有。Note: Left: Only one quality control line in negative plants. Right: Both quality control line and detection line in positive plants.圖3 水稻植株Cry1C*(A)和Cry2A(B)蛋白的陽性檢測Fig.3 Positive detection of Cry1C*(A) and Cry2A(B) protein in rice plant

2.3 旱恢3CA的Cry1C*和Cry2A蛋白的定量測定

在分蘗期，采用ELISA試劑盒，分別以T1C-19和T2A-1為對照，對旱恢3CA的Cry1C*和Cry2A蛋白進行測定。由圖4可知，旱恢3CA中葉片和莖稈中的Cry1C*蛋白含量分別為1.93 μg·g-1FW和0.11 μg·g-1FW，T1C-19葉片和莖稈中的Cry1C*蛋白含量分別為2.64 μg·g-1FW和0.17 μg·g-1FW，表明cry1C*基因成功轉入旱恢3號并正常表達，新材料旱恢3CA葉片中Cry1C*蛋白含量顯著低于親本(P<0.05)。對旱恢3CA中的Cry2A蛋白含量進行定量檢測，結果顯示，葉片和莖稈中的Cry2A蛋白含量分別為62.65 μg·g-1FW和4.07 μg·g-1FW，而親本T2A-1葉片和莖稈中的Cry2A蛋白含量分別為62.68 μg·g-1FW 和3.97 μg·g-1FW。無論在葉片還是莖稈中，旱恢3CA的Cry2A蛋白含量與親本T2A-1相比均無顯著差異。

注：*表示旱恢3CA和T1C-19在P<0.05水平存在顯著差異。Note: * indicates significant difference at 0.05 level between Haihui 3CA and T1C-19 materials.圖4 水稻旱植株的Cry1C*和Cry2A蛋白含量測定結果Fig.4 Determination of Cry1C*and Cry2A protein content of leaves and stems in rice plants

2.4 正常打藥條件下的旱恢3CA和母本旱恢3號的農藝性狀比較

在正常水肥管理和打藥條件下，旱恢3CA和旱恢3號的生育期無明顯差異，且在株高、單株有效穗數(shù)、穗長、每穗粒數(shù)、結實率、千粒重及單株產量均無顯著差異(P>0.05，表2)，表明經過多代回交后，Cry1C*和Cry2A蛋白的轉入對旱恢3號的農藝性狀無顯著影響。

表2 旱恢3CA和旱恢3號的主要農藝性狀比較Table 2 Agronomic traits of Hanhui 3CA and Hanhui No 3

2.5 田間自然條件下的抗蟲性鑒定

在保證正常水肥，全生育期不防治螟蟲的大田管理條件下，雙價抗蟲材料旱恢3CA表現(xiàn)出對稻縱卷葉螟的高抗性，分蘗期葉片正常，未見卷葉，成熟期也未有白穗出現(xiàn)；而對照品種旱恢3號在分蘗期有83.2%的植株受到稻縱卷葉螟為害，葉片內卷，且有肉眼可見的白絲、蟲糞或有長短不一的條狀白斑(圖5-A、B)。在成熟期旱恢3CA無白穗，而30.2%的旱恢3號植株有白穗出現(xiàn)(圖6-A、B)。剝開莖稈觀察，旱恢3CA的莖稈光滑，無缺口和蟲糞，而被卷葉螟為害的旱恢3號植株莖稈有明顯的咬口，莖稈內有蟲糞(圖6-C、D)。

注：A：旱恢3號卷葉細節(jié)圖；B：旱恢3號(左)和旱恢3CA(右)植株在分蘗期的田間抗性表現(xiàn)。Note: A: The details of Hanhui No 3 plant rolled leaf. B: The field resistance performance between Hanhui No 3 (left) and Hanhui 3CA (right) plants at tillering stage.圖5 恢復系在田間的抗蟲性表現(xiàn)Fig.5 Insect resistance of rice restorer lines under field

注：A、B分別為旱恢3CA和旱恢3號植株成熟期的田間抗性表現(xiàn)；C、D為旱恢3CA(左)和旱恢3號(右)植株莖稈比較。Note: A and B showed the field resistance performance of Hanhui 3CA and Hanhui No 3 plants at maturity, respectively. C and D showed the comparison of stems between Hanhui 3CA (left) and Hanhui No 3 (right).圖6 旱恢3CA和旱恢3號成熟期植株在田間的抗蟲性表現(xiàn)Fig.6 Insect resistance of Hanhui 3CA and Hanhui No 3 at maturity under field

3 討論

現(xiàn)階段在農業(yè)生產上，害蟲防治主要采用農藥噴施方法，不利于環(huán)境保護和人類健康。隨著分子生物學和基因工程技術的發(fā)展，利用Bt基因創(chuàng)制培育抗蟲水稻新材料的技術已經十分成熟。然而，根據(jù)Bt棉商業(yè)化結果顯示，單價的Bt基因作物的大面積推廣種植，減少了化學殺蟲劑的使用，但同時迫使靶標害蟲長時間處于單一的選擇壓力下，容易導致害蟲抗性種群的產生[30-31]。

T1C-19和T2A-1分別攜帶cry1C*和cry2A基因，特異毒殺水稻鱗翅目蟲，效果顯著。為延緩螟蟲對Bt蛋白產生抗性，本研究將cry1C*和cry2A基因同時導入節(jié)水抗旱稻恢復系旱恢3號，獲得雙價聚合抗蟲新材料旱恢3CA，在分蘗期，旱恢3CA的Cry1C*蛋白含量較T1C-19有所下降，推測可能與Ubiquitin啟動子的同源性有關。因為T1C-19和T2A-1兩個供體材料中的cry1C*和cry2A基因均由Ubiquitin啟動子驅動，可能會引起基因沉默，與前人研究結果一致[29]。分子標記輔助選擇主要通過PCR技術對導入基因進行鑒定，但由于PCR技術過于靈敏，容易出現(xiàn)假陽性結果。因此，在PCR初期篩選的基礎上，采用Bt試紙條進行陽性復核，提高了目標植株的篩選準確度。挑選與輪回親本長勢相似的陽性材料進行回交，在選育流程中進行全生育期不打藥管理，剔除出現(xiàn)蟲斑、白穗的植株，加速了選育材料純合[32]。通過農藝性狀鑒定，旱恢3CA和輪回親本無顯著差異，可直接用于組合配制。

4 結論

本研究以T1C-19和T2A-1為供體，分別獲得含cry1C*基因的旱恢3號和含cry2A基因的旱恢3號中間材料，進一步通過雜交選育，獲得雙價Bt基因聚合新材料。通過田間自然條件下的抗蟲性鑒定，選育出對稻縱卷葉螟具有高度抗性的水稻新材料旱恢3CA，其基本農藝性狀與輪回親本旱恢3號無顯著差別，為培育既節(jié)水抗旱又高抗螟蟲的水稻品種奠定了材料基礎。