LncRNA XLOC_015132對山羊黑色素沉積的影響及其lncRNA-miRNA-mRNA軸的預測

付 琳 劉 麗 楊 恒 王高富 任航行 周 鵬董賢文 張 麗,*

(1 重慶市畜牧科學院/重慶市山羊工程技術研究中心，重慶 402460；2 重慶化工職業學院，重慶 401228; 3西南大學動物醫學院，重慶 402460)

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是大于200 nt的一種非編碼RNA。根據lncRNA與其靶基因在染色體上的位置關系，可以將lncRNA分為5個亞類：正義、反義、雙向、基因間和內含子lncRNA[1]。研究顯示，lncRNA可以通過轉錄、后轉錄和翻譯水平在多種癌癥[2]、炎癥[3]、纖維化[4]、血管生成[5]的發展和進程中發揮正向或反向的調控作用。黑色素瘤是一種常見的皮膚惡性腫瘤，目前對黑色素相關lncRNA功能的研究，大多來源于黑色素瘤及其細胞系，在惡性黑色素瘤中，lncRNA可通過多種機制發揮作用，其可能通過調控相關信號分子誘導上皮間質轉化、激活或抑制關鍵蛋白活性改變細胞外基質性能、或激活PI3K/AKT、Wnt/β-catenin、MAPK等信號通路活性，促進黑色素瘤的侵襲和轉移[6]。

LncRNAXLOC_015132是與色素調控密切相關的重要lncRNAs，其在不同膚色山羊皮膚組織間存在顯著差異表達，與其同時被鑒定到的還有呈現高度組織特異性和功能特異性的LncRNAXLOC_15448、HOTAIR等[7]。研究發現，LncRNAXLOC_15448可能通過XLOC_15448/miR-182-5p/MITF軸參與酉州烏羊皮膚黑色素細胞的生長及黑色素的沉積[8]，HOTAIR可能通過與HOXD10互作調控山羊皮膚黑色素細胞的分化與黑色素生成[9]。LncRNA可通過互作分子調控黑色素的沉積。Wei等[10]對黑色素瘤和皮膚痣的對比發現，UCA1能夠負調控抑癌基因miR-507，miR-507基因同時抑制叉頭盒M1(forkhead-boxM1，FOXM1)基因轉錄表達，推斷UCA1通過miR-507-FOXM1軸促進惡性黑色素瘤的生長和轉移。Ding等[11]研究發現，NEAT1海綿化miR-23a-3p能夠調節靶蛋白Krueppel樣因子3(krueppel-like factor 3，LF3)的表達；KLF3又被證明與多種腫瘤相關，推測NEAT1可能通過miR-23a-3p/KLF3 軸促進惡性黑色素瘤增殖、遷移和侵襲，表明lncRNA-miRNA-mRNA軸在黑色素瘤的增殖、生長和轉移中起到關鍵作用。但LncRNAXLOC_015132與色素沉積間的分子調控關系還鮮有報道。

酉州烏羊是迄今人們發現的唯一一種全身烏皮，眼、鼻、嘴、肛門、陰門等處可視黏膜也為烏色表型的山羊，是研究人類皮膚、黏膜黑變病的理想醫學模型[12]。本研究以酉州烏羊為試驗對象，酉州本地白山羊作為對照，研究LncRNAXLOC_015132基因在不同膚色上樣組織中的表達特性，并選取B16-F10小鼠黑色素瘤細胞作為細胞水平驗證對象，研究LncRNAXLOC_015132在黑色素瘤細胞增殖階段的表達情況，旨在通過對LncRNA XLOC_015132互作分子的預測，以及其靶基因功能的生物信息學分析，初步對LncRNA XLOC_015132調控黑色素沉積的功能探索提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇重慶市酉陽土家族苗族自治縣酉州烏羊國家級保種場中，飼養條件和日糧結構一致，年齡相近(3～4周歲)、體重20～25 kg的酉州烏羊及本地白山羊各3只，采集心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、大腦、背黑線處皮膚、腿肌等組織。將采集后的組織統一編號，經液氮處理后，于-80℃條件下長期保存。同時，因原代山羊黑色素瘤細胞未培養成功，本研究選取B16-F10小鼠黑色素瘤細胞作為細胞水平驗證對象，驗證LncRNAXLOC_015132在黑色素瘤細胞增殖階段的表達情況，B16-F10小鼠黑色素瘤細胞來源于重慶市山羊工程技術研究中心。黑色素瘤細胞增殖培養基使用RPMI1640培養基，購自北京gibco公司；胎牛血清購自新西蘭HyClone公司。

1.2 引物設計與合成

根據前期轉錄組測序得到LncRNA XLOC_015132序列，其全長為1 158 bp[7]。通過同源序列檢索，LncRNA XLOC_015132序列位于山羊基因組第25號染色體(NC_030832.1)rs3666465～rs3667620位置。搜索NCBI 中已經公布的山羊和小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的相應序列，使用軟件Prime 5.0設計引物(表1)，用于實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)試驗。引物由上海生工合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3 B16-F10黑色素細胞培養

將小鼠皮膚黑色素瘤細胞系B16-F10，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基進行細胞復蘇，以T25細胞培養瓶進行培養，觀察細胞的生長狀況并拍照，待細胞融合度達80%左右，使用0.25%胰酶消化后，離心收集細胞，以1.0×105個·mL-1的濃度鋪板于六孔板中，每個板3個重復，置于5% CO2、37℃的培養箱中培養，隔天換一次培養基，觀察細胞生長狀況，于1、3、5和7 d各取一板細胞用于提取RNA。

1.4 RNA的提取與反轉錄

利用RHAiso Plus(TaKaRa，大連)提取各個樣本總RNA，使用D2000r超微量分光光度計 (賽默飛世爾科技, 美國)檢測總RNA的濃度與純度，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。使用LnRcute LncRNA cDNA第一鏈合成試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa，大連)， 將RNA反轉錄成cDNA，并置于-20℃冰箱保存。

1.5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

按照SYBR Premix Ex Taq熒光定量檢測試劑盒(TaKaRa，大連)說明書，進行目的基因的qRT-PCR試驗。qRT-PCR反應體系為20 μL：模板cDNA 2 μL(25 ng·μL-1)、2 × SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)10 μL、ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL、上下游引物各0.4 μL(10 μmol·L-1)、RNase ddH2O 6.8 μL。反應程序：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃延伸35 s，40個循環。

1.6 生物信息學分析

利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和 miRBase(http://www.mirbase.org/)查詢靶基因和miRNA序列以及lncRNA靶miRNA預測。使用在線網站TargetScan 7.2 (http://bibiserv. techfak. unibielefeld. de/rnahybrid/)、miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)和miRBase用于miR-150-5p靶基因預測分析，取三者預測基因的交集，利用DAVID (https://david.ncifcrf.gov/)資源數據庫進行GO注釋分類和富集分析，利用KEGG Pathway進行基于信號通絡富集分析。

1.7 數據統計與分析

采用2-△△Ct方法對qRT-PCR結果進行處理，應用統計軟件SPSS 22進行方差分析和顯著性t檢驗，組內比較使用多重比較，不同小寫字母表示差異具有統計學意義(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 LncRNA XLOC_015132基因組織表達譜情況

以心臟組織為對照，對酉州烏羊和本地白山羊各組織進行LncRNAXLOC_015132基因的qRT-PCR試驗，結果顯示，LncRNAXLOC_015132在本地白山羊(圖1-A)和酉州烏羊(圖1-B)不同體組織中均有不同程度的表達。

注：A：本地白山羊； B：酉州烏羊。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note: A: Youzhou white goat. B: Youzhou dark goat. Different lowercase letters showed significant difference (P<0.05).The same as following.圖1 本地白山羊和酉州烏羊不同組織LncRNA XLOC_015132的相對表達量Fig.1 The relative expression of LncRNA XLOC_015132 mRNA in tissues of Youzhou white goat and Youzhou dark goat

LncRNAXLOC_015132基因在本地白山羊組織中的表達量由高到低依次為心臟、肌肉、肺、大腦、肝臟、皮膚、腎臟、脾臟組織。LncRNAXLOC_015132基因在心臟和肌肉中的表達量顯著高于其他組織，在肺中的表達量顯著高于脾臟、腎臟和皮膚組織，在大腦和肝臟組織中的表達量顯著高于脾臟組織，在脾臟、腎臟和皮膚組織中的表達量差異不顯著。

LncRNAXLOC_015132基因在酉州烏羊心臟中的表達量最高，其次為肺、肌肉、大腦、皮膚、腎臟、肝臟、脾臟組織。LncRNAXLOC_015132基因在心臟中的表達量顯著高于其他組織，在肺中的表達量顯著高于除肌肉外的其他組織，在肌肉、大腦、皮膚、腎臟中的表達量顯著高于脾臟組織，在腎臟、皮膚和肝臟組織中的表達量差異不顯著。

2.2 LncRNA XLOC_015132在成年酉州烏羊和本地白山羊相同組織的表達量比較

對LncRNAXLOC_015132基因在酉州烏羊和本地白山羊同一組織的表達情況進行比較，以本地白山羊各組織作為對照，結果如圖2所示。LncRNAXLOC_015132基因在酉州烏羊脾臟、肺、腎臟、大腦、皮膚組織中的表達量顯著高于本地白山羊，其余組織中的表達量差異不顯著，其中LncRNAXLOC_015132基因在酉州烏羊和本地白山羊皮膚中的表達量豐度差異最大。

注：內參基因：山羊甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)。*表示與本地白山羊組織相比差異顯著(P<0.05)。Note: Reference gene: Glyceraldehyde-3-phosphate of goat(GAPDH). *indicate significant difference compared with Youzhou white goat at 0.05 lvel.圖2 本地白山羊和酉州烏羊同一組織LncRNA XLOC_015132的相對表達量Fig.2 The relative expression of LncRNA XLOC_015132 mRNA in the same tissue of Youzhou white goat and Youzhou dark goat

2.3 LncRNA XLOC_015132小鼠B16-F10黑色素細胞增殖階段的相對表達情況

應用qRT-PCR檢測小鼠B16-F10黑色素細胞在增殖介質中培養1、3、5和7 d時LncRNAXLOC_015132基因的表達，用小鼠GAPDH內參基因的表達量進行校正。結果發現，LncRNAXLOC_015132的表達量隨著B16-F10黑色素細胞培養時間的延長而逐漸增長(圖3)，暗示LncRNAXLOC_015132的遞增表達可能與B16-F10黑色素細胞的增殖相關。

注：內參基因：小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)。Note: Reference gene: Glyceraldehyde-3-phosphate of mouse(GAPDH).圖3 LncRNA XLOC_015132在B16-F10細胞增殖階段的相對表達量Fig.3 Relative expression of LncRNA XLOC_015132 in the proliferation phase of B16-F10 cells

2.4 LncRNA XLOC_015132在黑色素瘤致病過程中互作分子的預測

2.4.1LncRNAXLOC_015132靶miRNA預測 運用miRBase在線軟件預測得到與LncRNAXLOC_015132結合的miRNA家族共16個，包括miR-6089、miR-4131-3p、miR-1587、miR2644、miR-3262、miR-3260-5p、miR-1285、miR-306/306-5p、miR-150/150-5p、miR319d/319h、miR-12301-5p、miR-12308b-3p、miR-1630、miR-2196、miR399a、miR3 627d，其中LncRNAXLOC_015132與多個物種的miR-150/150-5p有結合位點，如表2所示。

表2 LncRNA XLOC_015132靶miRNA統計Table 2 Statistics of target miRNA gene of LncRNA XLOC_015132

多篇文獻報道，miR-150-5p可作為黑色素瘤增殖、侵襲、轉移、診斷和預后的生物標志物[13-17]。結合2.2結果，將miR-150-5p作為LncRNAXLOC_015132的重要候選互作序列，進行LncRNA-miRNA-mRNA軸的預測分析，探究LncRNAXLOC_015132基因的調控作用。

2.4.2 miRNA預測靶基因預測和分析 利用miRBase在線數據庫查找miR-150-5p序列，對比發現人、小鼠、大鼠等物種的miR-150-5p成熟體序列“U U U G G C A A U G G U A G A A C U C A C A CU”在各物種之間高度保守。利用TargetScan 7.2、miRWalk和miRBase預測鼠miR-150-5p的潛在靶基因，選取靶基因的交集基因作為候選miRNAs的靶標基因。結果發現，3種軟件共同存在的miR-150-5p的靶基因數為46個(圖4和表3)，這些基因被用于后續GO注釋條目和KEGG通路富集分析。

圖4 miR-150-5p靶基因交集預測Fig.4 The intersection prediction of miR-150-5p target genes

表3 mus-miR-150-5p的靶基因預測統計Table 3 Statistics of target gene of miR-182-5p

2.4.3 靶基因GO富集分析及代謝通路分析 對上述獲得的46個靶基因集合進行分子功能、生物學過程、細胞組成層面的注釋分類和富集分析，如圖5所示。靶標基因GO富集顯示涉及大量的生物學調控過程，如對生物過程的調控、信號、定位、細胞增殖、免疫以及色素沉積等；分子功能主要富集在結合、催化活性、轉錄和翻譯調節等；細胞組成主要富集在細胞、細胞器、胞外區、膜等。

同時，對上述基因的KEGG信號通路富集分析和KEGG通路網絡分析(圖6、圖7)，結果發現大量癌癥候選靶標基因在Wnt、PI3K-AKT、Hippo、Hedgehog信號通路等顯著富集，如重組人細胞周期蛋白D2(G1/S-specific cyclin-D2,CCND2)(圖7)，在通路網絡中起到關鍵作用。

3 討論

近年來，lncRNAs因在致癌和癌癥進展中起到的重要作用而被廣泛關注，目前已在數百種腫瘤中發現了lncRNAs的異常表達。皮膚作為人體重要屏障、分泌和免疫的最外層器官，其惡性黑色素瘤的發病率和病死率不斷上升[8]。近年來已發現多種黑色素候選lncRNA，如lncRNA HOX轉錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)[18]、H19[19]、黑素瘤高表達非編碼RNA(melanoma highly expressed non-coding RNA，MHENCR)[20]等都被報道在惡性黑色素瘤組織中表達增加或缺失，參與惡性黑色素瘤侵襲與轉移途徑。本研究中，LncRNAXLOC_015132在酉州烏羊和本地白山羊組織中廣泛表達，其在酉州烏羊皮膚組織的表達量顯著高于本地白山羊，此結果與Ren等[7]的研究一致。LncRNAXLOC_015132基因隨小鼠B16-F10黑色素細胞的培養時間延長而表達量逐漸增長，也暗示了LncRNAXLOC_015132可能參與黑色素瘤細胞的增殖。本研究中LncRNAXLOC_015132的表達模式還與山羊黑色素沉積候選lncRNA，如LncRNAXLOC_15448和LncRNAHOTAIR基因在酉州烏羊皮膚組織中的表達特征一致，LncRNAXLOC_15448通過參與黑色素細胞的增殖調控黑色素的沉積過程[8]，LncRNAHOTAIR基因通過調控黑色素細胞的分化參與黑色素的沉積[9]。因此，本研究推測LncRNAXLOC_015132可能通過正向調控黑色素細胞的增殖調控山羊皮膚黑色素的沉積過程。

圖5 miR-150-5p靶基因GO富集分析Fig.5 GO enrichment analysis results of miR-150-5p target genes

圖6 miR-150-5p靶基因KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG Pathway enrichment results of miR-150-5p target genes

注：玫瑰紅色圓圈代表信號通路，紫色圓圈代表靶基因，圓圈的大小代表通路靶基因的數量，Note: Rose red circle represent signal pathways, purple circle represen target genes, the size of the circle represent the number of genes in the pathway target圖7 mus-miR-150-5p靶基因KEGG通路網絡分析Fig.7 KEGG Pathway enrichment results of mus-miR-150-5p target genes

本研究中，miR-150-5p作為LncRNAXLOC_015132的靶標分子，與黑色素瘤的增殖、侵襲、轉移、診斷息息相關。在黑色素瘤中，miR-150通過下調轉錄因子成髓細胞癌基因(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog,MYB)抑制黑色素瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[21]。miR-150-5p通過直接靶向黑色素瘤細胞中SIX1抑制細胞的增殖、遷移和侵襲[22]。miR-150-5p不僅是皮膚黑色素瘤轉移相關的潛在生物標志物，而且與腫瘤細胞存活的時間有關[23]。因此，miR-150-5p作為LncRNAXLOC_015132的靶標分子可能參與抑制靶基因的表達或調控細胞存活時間進而影響黑色素的沉積。miR-150-5p靶基因的GO分析顯示，其主要在細胞、細胞器、胞外區發揮結合、催化活性、轉錄和翻譯調控等分子功能，參與生物調節、細胞增殖及色素沉積等生物學進程的調控。而CCND2作為本研究中miR-150-5p的靶基因，能夠被miR-182和轉錄因子NF-kB下調從而參與黑色素瘤細胞的增殖、侵襲和轉移[24-25]。因此，LncRNAXLOC_015132的互作分子miR-150-5p可能通過抑制CCND2下調參與黑色素瘤細胞的增殖過程，調控皮膚黑色素的沉積。研究發現，lncRNAs和miRNAs可以通過多種靶位參與腫瘤的發生過程，其作用方式如lncRNAs作為miRNA海綿/誘餌分子；lncRNAs和miRNAs相互促進；lncRNA和miRNA相互抑制；miRNA作為lncRNA的負調節劑等。如Liang等[26]發現lncRNA-ZFAS1對黑色素瘤有促腫瘤作用，并且ZFAS1/miR-150-5p/RAB9A軸能夠調控黑色素瘤細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲。LncRNA-MEG3通過調節miR-21/E-cadherin軸促進黑色素瘤的生長、轉移和形成[27]。結合本研究生物信息學分析結果及前人研究報道，推測LncRNAXLOC_015132/miR-150-5p/CCND2軸可能在黑色素沉積過程中發揮重要的調控作用，但LncRNAXLOC_015132作用于miR-150-5p/CCND2的方式還需要進一步研究。

本研究KEGG富集分析顯示，LncRNAXLOC_015132/miR-150-5p的靶基因，如CCND2，在PI3K-AKT、Wnt等信號通路中起到關鍵樞紐作用。PI3K/AKT通路的異常激活與細胞增殖、存活、遷移、侵襲、轉移和腫瘤生長顯著相關[28]。Wnt通路的失調影響包括癌癥在內的各種疾病發生[29]。前人研究發現，少數lncRNAs通過直接或間接的方式促進PI3K-AKT、Wnt信號通路活性來發揮其功能[30-31]。LncRNAFER1L4通過促進抑癌基因PTEN(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten)表達來抑制蛋白激酶B(protein Kinase B,AKT)活性[32]。LncRNABC087858通過上調轉錄因子ZEB1(Zinc-finger E-box binding homeobox 1,ZEB1)和Snail(Zinc-finger transcriptional factor snail,Snail)參與PI3K/AKT信號通路和上皮間質轉化[33]。miR-34a-5p與LncRNAC2dat1負相關，通過抑制沉默調節蛋白1(silent mating type information regulation 2 homolog 1,Sirt1)使p38/ERK/AKT和Wnt信號通路失活[34]。LncRNAMEG3作為內源性海綿分子與miR-127結合調控靶基因ZEB1，促使骨肉瘤細胞的生長和轉移，其中miR-127和ZEB1都參與激活JNK和Wnt信號通路[35]。因此，LncRNAXLOC_015132的靶分子miR-150-5p也可能通過靶基因CCND2調控PI3K-AKT、Wnt等信號通路，促進黑色素瘤細胞增殖，但具體機制還有待進一步研究。

4 結論

本研究發現LncRNAXLOC_015132在山羊各組織中廣泛表達，其在酉州烏羊皮膚中的表達顯著高于本地白山羊；在小鼠B16-F10黑色素瘤細胞中，LncRNAXLOC_015132的表達量隨著黑色素細胞的增殖呈遞增趨勢，結果顯示LncRNAXLOC_015132可能與黑色素沉積存在正相關關系。對LncRNAXLOC_015132靶標分子的生物信息學分析顯示，LncRNA XLOC_015132/miR-150-5p/CCND2軸可能在黑色素沉積中發揮重要作用，其機制可能是LncRNAXLOC_015132通過miR-150-5p/CCND2激活PI3K-AKT、Wnt等信號通路，促進黑色素細胞的增殖，調控黑色素的沉積過程。