不同烤煙種植模式對貴州土壤養分、酶活性及細菌群落結構的影響

芶久蘭 顧小鳳 張 萌 魏全全 柳玲玲

(貴州省農業科學院土壤肥料研究所，貴州 貴陽 550006)

煙草(Nicotianatabacum)是我國重要的經濟作物之一。據統計，2019年貴州烤煙種植面積達194萬畝，是我國第二大烤煙種植省份，僅次于云南[1]。然而，隨著近年來貴州烤煙產業的快速發展，烤煙連作現象越來越突出。烤煙連作不僅影響煙葉質量與品質，而且會使土壤養分失衡，進而影響土壤微生態環境[2-3]。因此，如何合理有效地緩解貴州烤煙連作障礙、均衡土壤地力水平以及改善土壤微生態環境，成為目前亟待解決的重要問題。

近年來，通過合理輪作來改善和解決烤煙連作障礙的研究日益增多。合理輪作可以明顯增加土壤中細菌數量，顯著降低真菌數量，提高群落多樣性[4]。不同耕作方式、作物類型、施肥和種植制度的變化均會影響或改變土壤微生物群落功能多樣性[5-10]。烤煙輪作對土壤的影響主要集中在對土壤理化性質及根際微環境的影響。研究發現烤煙與豆科植物進行輪作能增加土壤養分含量[11]。吳文濤等[12]和黎妍妍等[13]研究均表明，煙草與萬壽菊輪作可以有效提高土壤中自生固氮菌、無機磷細菌等有益功能菌群的數量，提高煙株根際土壤細菌群落Shannon和Chao1等多樣性和豐富度指數，并且增強土壤細菌群落響應脅迫的修復能力。同時有學者發現,玉米是控制煙草枯萎病的有效輪作作物，玉米烤煙輪作可以提高土壤中酸性細菌和放線菌的豐富度[14]。釧有聰等[15]通過大蒜與烤煙輪作對煙草黑脛病的防治效果及作用機理進行初探，發現大蒜和烤煙輪作可以降低煙草黑脛病的發生和危害。陳丹梅等[16]研究則指出烤煙-苕子-水稻的輪作模式可改善土壤生態環境，促進微生物繁衍。由此可見，合理的烤煙輪作可以有效均衡土壤養分，改善土壤環境，有助于烤煙良好循環種植。

綠肥作為一種重要的有機肥料，在減少化肥用量、提高作物產量、培肥土壤地力等方面發揮著積極作用。包明等[17]研究指出，在渭北旱塬地區施用綠肥一定程度上可提高該區域的土壤肥力。同時，綠肥可促進烤煙根際微生物的生長和繁殖，提高煙田土壤細菌群落多樣性及均一度[18]。楊帥等[19]發現將綠肥與烤煙進行輪作，能夠顯著提高土壤有效氮的轉化，保證煙株氮素的供應；綠肥輪作后能改善植煙土壤細菌結構，提高有機質、全氮、速效養分含量，從而提供大量碳源和氮源，使土壤細菌Shannon指數明顯提高[20]。張超[21]的研究證明，綠肥還能提高土壤酶活性，改善土壤微生態條件，從而減輕作物土傳性病害發病率。不同綠肥之間，禾本科綠肥對土壤微生物量和土壤酶活性的影響最大，其次是豆科綠肥[22]。以往關于烤煙合理輪作的研究已有報道，但針對貴州烤煙輪作的研究較少。因此，本研究通過大田試驗，定量分析不同烤煙種植模式對貴州土壤養分、酶活性及細菌群落結構的影響，以期為貴州烤煙的合理高效種植模式提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

本試驗于2018年10月—2020年8月在貴州省畢節市黔西縣永燊彝族苗族鄉(106°11′41″E，27°7′34″N)進行，平均海拔1 205 m。供試土壤為貴州典型石灰巖發育的黃壤，其基本理化性質如下：pH值5.92，有機質含量18.59 g·kg-1，全氮含量1.31 g·kg-1，有效磷含量16.60 mg·kg-1，速效鉀含量232.00 mg·kg-1。 供試烤煙品種為畢納1號，由畢節市煙草公司黔西縣分公司提供。供試有機肥為酒糟有機肥(N+P2O5+K2O=6.2%)，供試化肥為烤煙專用基肥(N∶P2O5∶K2O=10∶15∶24)、烤煙提苗肥(N∶P2O5∶K2O=15∶8∶7)和烤煙專用追肥(N∶P2O5∶K2O=13∶0∶126)，均由畢節市煙草公司黔西縣分公司提供。綠肥品種為66-25箭筈豌豆，由畢節市黔西縣土肥站提供。

1.2 試驗設計

試驗采取隨機區組試驗設計，設置4個處理：烤煙連作(T)；白菜-烤煙輪作(C-T)；豌豆-烤煙輪作(P-T)；綠肥-烤煙輪作(GM-T)。每個試驗小區面積為42 m2，不同小區設置0.5 m隔離帶，每個處理設置3次重復。烤煙行距1.05 m，株距0.57 m，種植密度16 500株·hm-2。在烤煙種植過程中，每個小區的管理方式一致。在施肥過程中，根據等量養分原則，T和C-T處理施肥一致，P-T處理直接將豌豆翻壓于地里，GM-T處理直接將綠肥翻壓于地里，豌豆和綠肥的養分含量及水分含量如表1所示，計算后將P-T和GM-T的專用基肥和追肥分別減少80 kg·hm-2和110 kg·hm-2。各處理具體施肥量如表2所示。

表1 豌豆和綠肥的養分含量情況Table 1 Nutrient content of pea and green manure /%

表2 不同處理的肥料施用量Table 2 Fertilizer application amount for different treatments /(kg·hm-2)

1.3 土壤樣品的采集

本試驗于2020年8月烤煙采收結束后，在每個小區按照“S”型土壤取樣法設置15個采樣點，每個采樣點采集0～20 cm土壤樣品。將枯枝落葉、碎石等雜物剔除后把每個土壤樣品分為三部分：第一部分用錫箔紙包裹，迅速裝入離心管，投入液氮冷凍運輸，之后轉移至-80℃冰箱保存，用于土壤微生物高通量測序分析；第二部分采集新鮮土樣用于銨態氮(ammonium nitrogen, AN)、硝態氮(nitrate nitrogen, NN)、微生物量碳(microbial biomass carbon, MBC)、微生物量氮(microbial biomass nitrogen, MBN)和微生物量磷(microbial biomass phosphorus, MBP)的測定；第三部分將新鮮樣品自然風干、研磨過篩后用于土壤pH值、有機質(soil organic matter, SOM)、陽離子交換量(cation exchange capacity, CEC)、全氮(total nitrogen, TN)、有效磷(available phosphorus, AP)、速效鉀(available potassium, AK)、脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶和過氧化氫酶的測定。

1.4 測定項目與方法

1.4.1 土壤理化性質測定 土壤理化性質按照《土壤農化分析》[23]進行。土壤pH值采用電位測定，土壤有機質采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法測定，土壤CEC采用BaCl2-MgSO4強迫交換法測定，土壤全氮含量采用半微量凱氏定氮法測定，土壤銨態氮和硝態氮用1 mol·L-1KCl溶液浸-連續流動分析儀(AA3，德國布朗盧比公司)測定，土壤有效磷采用鹽酸-氟化銨提取-鉬銻抗比色法測定，土壤速效鉀采用醋酸銨-火焰光度計(FP640，上海傲譜分析儀器有限公司)法測定，土壤微生物量碳、微生物量氮和微生物量磷采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法測定，脲酶采用靛酚藍比色法測定，蔗糖酶采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定，酸性磷酸酶采用硝基酚比色法測定，過氧化氫酶采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定。

1.4.2 土壤DNA提取和16S rRNA基因高通量測序 每個樣品稱取相當于0.5 g干土重量的新鮮土壤，采用FastDNA?SPIN Kit for Soil(MPBiomedicals)試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取土壤微生物總DNA，1%瓊脂糖電泳檢測DNA樣品是否降解以及有無雜質，使用Nanodrop 2000分光光度計[賽默飛世爾科技(中國)有限公司提供]檢測樣品純度。經DNA濃度和純度檢測后(DNA濃度≥20 ng·μL-1，總量≥500 ng，D260/280為1.8～2.0)，利用ABI Gene Amp?9700型PCR儀[美國應用生物系統公司(ABI)]對細菌16S rRNA基因進行PCR引物擴增，擴增引物為338F(5′-A C T C C T A C G G G A G G C A G C AG-3′)和806R(5′-G G A C T A H V G G G T W T C T A AT-3′)。PCR反應體系為20 μL：5×TransStart FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mol·L-1dNTPs 2 μL，上游引物(5 μmol·L-1) 0.8 μL，下游引物(5 μmol·L-1) 0.8 μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，用滅菌蒸餾水補足至20 μL。PCR擴增程序：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，27個循環；72℃終延伸10 min，4℃保存。每個樣本3個重復，獲得擴增產物后，進一步通過2%瓊脂凝膠電泳檢測PCR產物純化效果，測定純化后PCR產物的濃度，將土壤樣品16S rRNA基因的PCR純化產物等按摩爾系數混合，利用Thermo Scientific 公司(上海)的GeneJET膠回收試劑盒，割膠回收目標條帶，測序服務委托上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.5 統計與分析

采用Mothur軟件計算多樣性指數，包括Chaol、Shannon和Simpson指數，采用Canoco 4.5 軟件進行冗余分析(redundancy analysis，RDA)，采用Origin 8.0軟件進行作圖，利用SPSS 20.0軟件進行方差分析。圖表中數據為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 種植模式對土壤養分的影響

由表3可知，烤煙輪作后，土壤pH值提升了1.19%～1.58%。此外，輪作在一定程度上對土壤養分含量也產生了影響，提升了土壤有機質、陽離子交換量、全氮、微生物量碳、微生物量氮和微生物量磷含量。與T處理相比，烤煙輪作使SOM、CEC、TN、MBC、MBN和MBP分別提高了0.77%～12.44%、10.78%～38.51%、11.76%～17.65%、10.65%～20.67%、36.58%～160.36%和14.66%～36.21%，均以GM-T處理增幅最大，GM-T處理與其余處理的MBN含量達顯著差異水平。與T處理相比，輪作的土壤銨態氮、硝態氮、有效磷和速效鉀含量有所降低，分別降低了1.01%～71.67%、19.29%～24.32%、23.09%～52.21%和6.18%～10.09%，且輪作各處理的硝態氮和有效磷含量均與T處理間差異顯著。

表3 不同處理的土壤養分含量Table 3 Soil nutrient status of different treatments

2.2 種植模式對土壤酶活性的影響

如表4所示，烤煙輪作對土壤脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶和過氧化氫酶活性有不同程度的影響。與T處理相比，烤煙輪作使土壤脲酶和蔗糖酶活性分別提高了12.38%～42.96%和4.00%～22.67%，均以GM-T處理最高，GM-T的脲酶活性與T和C-T兩處理間差異顯著；烤煙輪作使酸性磷酸酶和過氧化氫酶活性分別降低了8.16%～24.17%和2.66%～15.80%，其中C-T處理的酸性磷酸酶活性與T處理差異顯著，各處理的過氧化氫酶活性差異均不顯著。

表4 不同處理的土壤酶活性Table 4 Soil enzyme activities of different treatments

2.3 種植模式對土壤細菌群落組成的影響

通過對土壤樣品進行檢測發現(圖1)，土壤細菌共得到21 952個操作分類單元(operational taxonomic units, OTU)，其中T、C-T、P-T和GM-T處理的OTU數量分別為7 764、7 937、7 910和9 830個。4個處理的共同OTU為1 827個，分別占T、C-T、P-T和GM-T處理總OTU數量的23.5%、23.0%、23.1%和18.6%。T、C-T、P-T和GM-T處理各自特有的OTU數分別為3 360、 3 414、3 385和5 458，占相應處理總OTU數量的43.3%、43.0%、42.8%和55.5%。

圖1 土壤中細菌OTU數量Venn圖Fig.1 Venn diagram of bacteria OTU in soil

2.4 種植模式對土壤細菌群落多樣性指數的影響

由表5可知，烤煙輪作改變了土壤細菌群落多樣性指數。與T處理相比，烤煙輪作提高了Chaol和Shannon指數，增幅分別為1.5%～11.1%和0.3%～3.2%，均以GM-T處理增幅最大。烤煙輪作處理降低了Simpson指數，降幅為0.0%～0.2%，以GM-T處理降幅最大。綜上，綠肥-烤煙輪作模式可以更好地提高土壤細菌群落多樣性。

表5 種植模式對土壤細菌群落多樣性指數的影響Table 5 Effects of planting patterns on soil bacterial community diversity index

2.5 種植模式對土壤細菌群落豐度和多樣性的影響

2.5.1 種植模式對土壤細菌門水平群落結構的影響 通過對不同種植模式下的土壤細菌群落組成進行分析發現，在門水平上共檢測出34個細菌種類和未確定類群，T、C-T、P-T和GM-T處理分別有26、32、26和29個門(圖2)。其中，變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)的相對豐度較高，分別為30.8%～38.3%、24.9%～36.8%、9.9%～11.9%、7.9%～11.3%和6.1%～7.3%。進一步分析發現，烤煙輪作改變了土壤中細菌優勢菌種的豐度。與T處理相比，烤煙輪作使土壤中變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度提高了0.4～7.5個百分點，而酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)的相對豐度則分別降低了0.6～2.0個百分點和1.9～3.4個百分點。

圖2 種植模式下土壤細菌門水平上主要菌落相對豐度Fig.2 Planting patterns of major microflora at phylum level in soil

圖3 種植模式下土壤細菌屬水平上主要菌落相對豐度Fig.3 Planting patterns of major microflora at genus level in soil

2.5.2 種植模式對土壤細菌屬水平群落結構的影響 在屬水平上共檢測出909個細菌種類和未確定類群，T、C-T、P-T和GM-T處理分別有597、666、610和687個屬(圖3)。其中，JG30-KF-AS9、嗜食單胞菌(Sphingomonas)、鏈霉菌(Streptomyces)、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)和擬無枝酸菌屬(Amycolatopsis)的相對豐度較高，分別為3.4%～5.7%、3.2%～5.6%、1.7%～4.4%、2.7%～3.1%和0.9%～2.7%。進一步分析發現，與T處理相比，烤煙輪作使嗜食單胞菌(Sphingomonas)、羅丹桿菌(Rhodanobacter)和桿菌屬(Bryobacter)相對豐度分別提升0.9～2.4個百分點、0.2～0.5個百分點和0.2～0.4個百分點，均以P-T處理增幅最高；鏈霉菌(Streptomyces)相對豐度下降0.4～2.6個百分點。

2.5.3 種植模式對土壤微生物群落結構影響的線性判別分析及影響因子 通過對不同種植模式下的土壤細菌群落進行LefSe分析發現(圖4)，輪作可以增加土壤中有重要作用的微生物類群數量，T處理僅有2種，C-T處理增加至5種，P-T處理增加至3種，GM-T處理增加至6種。進一步分析發現，在各個處理中，對土壤具有重要作用的細菌各不相同，具體表現如下：T處理為Pedosphaeraceae；C-T處理有嗜紅桿菌(Altererythrobacter)、諾卡氏菌(Nocardia)、放線菌(Actinophytocola)和擬無枝酸菌(Amycolatopsis)；P-T處理有柯氏桿菌(Coxiella)；GM-T處理為粘菌(Mucilaginibacter)、關節桿菌(Arthrobacter)、Pedosphaeraceae、Devosiaceae和變形細菌(Proteobacteria)。

圖4 土壤細菌群落LefSe分析Fig.4 LefSe analysis of soil bacterial community

2.6 土壤細菌群落結構與土壤養分的冗余分析

根據統計分析的結果，將土壤養分與細菌群落前16個優勢菌屬進行RDA冗余分析(圖5)，結果顯示，第1軸解釋率為38.1%，第2軸解釋率為28.5%，累積解釋率為66.6%。MBP對群落變異的解釋度為23.5%，AP為22.1%，AN為18.9%，因此推測MBP是驅動群落變異的主要因子。MBP與黃桿菌屬和褚氏桿菌屬，AP和AN與鏈霉菌屬和擬無枝酸桿菌均呈正相關關系。

圖5 土壤細菌群落結構與土壤養分的冗余分析(屬水平)Fig.5 Redundancy analysis of soil bacterial community structure and soil nutrient (genus)

3 討論

3.1 種植模式對土壤養分的影響

連作會導致土壤酸化，降低土壤肥力[24]。輪作不僅能夠提高土壤肥力，提升土壤的有機質和全氮含量[10]，而且可以改善煙草健康狀況[21]。本試驗發現，輪作后的土壤pH值較連作處理有所提升，這可能是因為長期連作會降低土壤微生物多樣性和酶活性，使土壤酸化。可見，烤煙輪作可改善連作帶來的土壤酸化問題。

輪作后的土壤有機質、陽離子交換量、全氮、微生物量碳、微生物量氮和微生物量磷含量均有明顯提高，且以GM-T處理效果最佳，P-T處理次之，這與譚玉蘭等[25]和賈志紅等[26]的研究結果一致，一方面是因為烤煙生長過程中，氮素是最重要的元素，烤煙連作造成了土壤中氮素缺失，而輪作可減輕土壤中氮素的供給壓力；另一方面，豆科植物具有固氮作用，可以優化土壤的理化性質，熟化土壤肥力，能夠有效改善土壤質量[27-28]，同時有學者[21, 29]證明綠肥-烤煙輪作能夠明顯增強土壤中活性有機質的含量，從而提高土壤中碳和氮的含量。

在本試驗中，與連作處理相比，輪作處理土壤中的銨態氮、硝態氮、有效磷和速效鉀含量有所降低，與前人[30-33]研究結果一致，這可能是因為在施入養分含量相同的情況下，輪作提高了烤煙的根系根長，擴大了根系與養分的接觸面積，提高了養分的吸收量[30]，所以連作烤煙可能導致土壤中速效養分的累積，造成土壤養分失衡。

土壤中的磷酸酶和脲酶活性在一定程度上可分別反映土壤中有機磷的生物有效性和供氮能力，蔗糖酶活性反映土壤熟化程度和肥力水平，過氧化氫酶活性可以用來表征土壤腐殖化強度和有機質的積累程度[22]。連作使土壤中酶活性受到抑制，而輪作可以提高土壤中的酶活性[34-35]。在本試驗中，烤煙輪作提高了土壤中的脲酶和蔗糖酶活性，這與張科等[31]和官會林等[36]的研究結果一致。本試驗的3個輪作處理中，GM-T處理提升效果最好，一方面可能是因為綠肥腐解過程中，需要大量微生物的參與，微生物活性增強，從而促進了土壤酶活性的提高[37]；另一方面，綠肥能夠固氮、吸碳，在煙株根系發育過程中提供大量有機營養，使根系分泌物增多，微生物繁殖速度加快，從而提高了土壤酶活性[38]。

3.2 種植模式對土壤細菌群落結構多樣性的影響

土壤微生物在維持土壤肥力、促進土壤養分循環等方面具有重要的作用[39]。種植模式的改變必然會直接或間接地影響土壤微生物群落多樣性。研究表明，烤煙輪作和綠肥還田可以明顯增加土壤細菌和放線菌數量，增加土壤微生物的生物多樣性，改變微生物群落結構[40-42]。本研究發現，T處理的OTU數量和土壤細菌種類均為最少；而烤煙輪作改變了細菌群落結構多樣性，與T處理對比，C-T處理中放線菌門(Actinobacteria)的相對豐度提升，GM-T處理提升了變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度，與前人研究結果較為吻合[16，40]。這是因為煙草在連作條件下，根系分泌物中有毒物質的積累可使根系受害，影響根系微生物的數量、種群和土壤微生物的代謝、生長和發育，而且烤煙連作破壞了煙草根際土壤細菌群落的平衡，使煙草的生存微環境不斷惡化；而輪作方式可以提高植煙土壤細菌群落的多樣性，并且隨輪作年份的增加，輪作處理根際土壤細菌含量高于單作烤煙的趨勢越來越明顯[43-44]。GM-T處理的綠肥為豆科植物，根部聚集固氮菌進行大量固氮，導致土壤氮源增加，變形菌門隨之增加[45]。

烤煙連作降低了表征菌群豐度的Chaol指數和物種豐富度的Shannon指數[6]。在本研究中，烤煙輪作處理的Chaol和Shannon指數均高于連作，特別是GM-T處理，與段玉琪等[43]的研究結果一致。這是因為種植綠肥可調節土壤碳氮比，提供大量碳源和氮源從而影響土壤微生物活性，改變土壤微生物群落組成和功能，使土壤細菌中Shannon指數明顯提高[20, 46]。桿菌類細菌是土壤中可促進作物生長，增強土壤中難分解肥效元素的分解和抑制土傳病菌危害的多功能微生物[47]。在連作土壤中添加桿菌，能有效克服設施蔬菜的連作障礙，降低連作障礙病原菌數量，提高土壤酶活性，并促進植株生長[48]。本試驗中LefSe分析顯示，烤煙輪作后，土壤中有重要作用的微生物類群數量增多，主要增多的微生物類群為桿菌類，與細菌屬水平群落結構分析的結果一致；同時冗余分析顯示，MBP是驅動群落變異的主要因子，且MBP與桿菌類細菌呈正相關關系。這與前文提到的研究結果一致，說明烤煙輪作能有效提高土壤中的有益菌群，從而改善土壤條件并促進烤煙生長。

4 結論

本研究結果表明，烤煙輪作可均衡土壤中的養分含量，提高土壤酶活性。輪作后，土壤細菌群落結構和多樣性有所改善，變形菌門(Proteobacteria)、嗜食單胞菌(Sphingomonas)、羅丹桿菌(Rhodanobacter)和桿菌屬(Bryobacter)的相對豐度有所提高。MBP是驅動群落變異的主要因子，通過改變桿菌類細菌來達到改善土壤微環境的效果。因此，在貴州進行烤煙輪作，特別是綠肥-烤煙輪作制度能夠在一定程度上提高土壤養分含量，并增加土壤有益微生物菌群，為烤煙的良好循環種植提供基礎。