葡萄糖轉運體8 的生物信息學分析

高 晗，趙 貝

（大理大學基礎醫學院，云南 大理 671000）

在大腦中表達的葡萄糖轉運體有兩種，一種是包含非鈉依賴性葡萄糖轉運體（glucose transporter，GLUT），另一種是鈉依賴性GLUT。不同的GLUT 在大腦中不同位置和細胞中表達，以保證大腦正常的能量代謝。研究表明[1-3]，GLUT8 大腦中在皮質、小腦、下丘腦、海馬中均有表達，而在大鼠腦中，GLUT8在神經元中普遍表達，但不在星形膠質細胞或者小膠質細胞中表達。雖然GLUT8 和GLUT3 都在神經元上表達，但其表達的位置不同。GLTU8 定位在神經元胞體和近端頂端樹突上，參與了海馬神經元的能量供應[4]。在哺乳動物大腦發育過程中，GLUT8 表達增加可為大腦發育提供能量[5]。但目前尚未確定GLUT8 是否接受D-半乳糖、D-果糖、磷酸化單糖作為底物，同時GLUT8 在大腦中的生理功能、調節機制及病理生理影響尚不明確。基于此，本研究通過在線軟件分析對GLUT8 的結構和功能進行生物信息學分析，以期為進一步研究GLUT8 在大腦中的生理功能、調節機制和病理生理機制提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 數據資料 通過美國國家生物技術信息技術中心NCBI數據庫（https://www.ncbi.nlm.nil.gov）對GLUT8 進行序列分析；登錄Uniprot 蛋白數據分析庫和NCBI 網站，獲取GLUT8 的基因序列和氨基酸序列。

1.2 生物信息學分析 ①理化性質分析：通過在線軟件Expasy 的ProtParam Pool 和ProtScale 分別對GLUT8 進行理化性質和親疏水性分析；②蛋白跨膜區域、亞細胞定位和細胞信號肽的預測：通過TMHMM（TMHMM Server V 2.0）和SignalP 4.1 對GLUT8對跨膜區域和信號肽預測；通過ProtCrop-Version對GLUT8 細胞定位分析；③蛋白糖基化分析：通過YinOYang 1.2 Server 分析GLUT8 的O-糖基化位點；通過NecNGlyc 1.0 Server 分析GLUT8 的N-糖基化位點；④蛋白磷酸化位點預測：通過NetPho3.1在線工具預測GLUT8 的磷酸化位點；⑤蛋白二、三級結構分析：通過在線工具SOPMA 分析GLUT8 的二級結構；另通過SWISS-MODEL 和UniProt 網址分析GLUT8 的三級結構；⑥蛋白相互作用分析：通過UniProt 的Inertation 數據庫對GLUT8 蛋白進行二元相互作用分析；另通過UniProt 的STRING 數據庫進行蛋白相互作用網絡分析。

2 結果

2.1 蛋白基因及編碼蛋白的基本信息 GLUT8 蛋白由SLC2A8 編輯，位于9q33.3，全長10 759 bp，包含11 個外顯子，477 個氨基酸。基因ID：29 988，基因組序列為NC-000009，蛋白質NP-055395.2。

2.2 蛋白質的理化性質及親疏水性分析 GLUT8 有477 個氨基酸，其中丙氨酸（Ala）占12.8%，亮氨酸（Leu）占13.8%，其他氨基酸的占比均小于10%。帶負電荷殘疾的天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）的總數為28，正電荷殘疾的精氨酸（Arg）和賴氨酸（Lys）的總數為29。相對分子質量為50 819.08。分子式為C2361H3665N587O661S24，原子總數為7298。不穩定指數（Ⅱ）為41.07。理論等電點pⅠ為7.55。蛋白脂肪系數為110.25。通過ProtScale 獲得GLUT8 蛋白親疏水性氨基酸殘基的分布圖，結果顯示氨基酸親水性得分最大值為2.56，最小值為-3.33，標度值＞0 區域比＜0 區域密集；總平均親水性為（GRAVY）0.73，見圖1。

圖1 GLUT8 蛋白親水性分析

2.3 蛋白的跨膜區域以及亞細胞定位 TMHMM Server.2.0 工具在線分析顯示，GLUT8 蛋白有12 個跨膜結構域，見圖2。ProtCrop-Version 9 分析顯示，GLUT8 蛋白主要定位于細胞膜和細胞質內，見表1。SignalP 4.1 軟件在線分析顯示，GLUT8 蛋白信號肽中Cmax在42，為0.127；Ymax在42，為0.161；Smax在30，為0.262，見圖3。

表1 GLUT8 蛋白的亞細胞定位

圖2 GLUT8 蛋白的跨膜結構域分析

圖3 GLUT8 蛋白信號肽分析

2.4 蛋白的糖基化分析 GLUT8 蛋白有5 個O-糖基化位點，分別在47、333、350、356、360 位。N-糖基化分析顯示，GLUT8 蛋白有1 個N-糖基化位點，在349 位，見圖4、圖5。

圖4 GLUT8 蛋白O-糖基化分析

圖5 GLUT8 蛋白N-糖基化分析

2.5 蛋白的磷酸化位點分析 GLUT8 蛋白共有24 個磷酸位點，見圖6。其中，絲氨酸（Ser）磷酸化位點12個，蘇氨酸（Thr）磷酸化位點10 個，酪氨酸（Tyr）磷酸化位點2 個，見表2。

表2 GLUT8 蛋白磷酸化位點預測

圖6 GLUT8 蛋白磷酸化位點分析

2.6 蛋白的二級結構和三級結構分析 二級結構：采用SWISS MODEL 軟件分析GLUT8 蛋白的三維立體結構，該模型的GEMQ 評分為0.63 分，平均QMEAN 評分為（0.66±0.05）分，見圖7。三級結構：采用SPOMA 軟件分析GLUT8 蛋白的二級結構，其中α-螺旋（Hh）231 個，占48.43%；無規則卷曲（Cc）135 個，占28.3%；β 折疊（Ee）89 個，18.66%；β 轉角（Tt）22 個，占4.61%，見圖8。

圖7 GLUT8 蛋白三級結構分析

圖8 GLUT8 蛋白二級結構分析

2.7 蛋白的相互作用分析 GLUT8 蛋白共與46 個蛋白有二元相互作用，見圖9。蛋白相互作用網絡分析顯示，GLUT8 蛋白與10 個蛋白有相互作用，分別是SLC5A1、SLC23A1、FAM162A、MAP3K14、MRPS33、NPEPL1、CHSY3、AP2A1、AP2A2、AP2B1，見圖10。

圖9 GLUT8 蛋白二元相互作用網絡

圖10 GLUT8 蛋白相互作用網絡

3 討論

腦細胞不能儲存和合成葡萄糖，因此人腦幾乎完全依賴葡萄糖作為能量來源。大腦需要源源不斷的葡萄糖供應來維持腦細胞正常活動、神經遞質的合成和神經突觸形成[6]。而葡萄糖是一種極性大分子物質，不能通過單純擴散穿過質膜的雙層脂質層[7]，因此需要轉運載體進入細胞。GLUT 家族蛋白是糖轉運蛋白亞家族成員，現有14 個成員[5]，不同的GLUT 分布在不同的組織和細胞中，特定的GLUT 促進不同的底物進入細胞，如葡萄糖、果糖、肌醇等。GLUT8 是繼GLUT4 后第2 個由胰島素調節的葡萄糖轉運體[8]，具有高親和力葡萄糖轉運活性（Km=2 mmol/L）[9]。GLUT8 的底物現已確定的有葡萄糖[10]、海藻糖[11]、己糖[12]，海藻糖的攝入可以上調大腦中的GLUT8 的表達[13]，除葡萄糖外尚未確定這些底物的Km 值。除了在海馬體中高表達，GLUT8 還在學習和記憶、探索、恐懼、焦慮、多動等行為特征的腦區中發揮作用[14-17]。Schmidt S 等[18]在GLUT8 敲除小鼠中發現，小鼠表現為過度活躍且行為學實驗有明顯改變，這種改變是由GLUT8 引起的葡萄糖代謝障礙導致神經元功能障礙的結果。另有實驗研究顯示[10]，GLUT8 可能是將葡萄糖從粗面內質網運輸到細胞質中，而且GLUT8 可能影響海馬的葡萄糖穩態。海馬在大腦中具有至關重要的作用，而GLUT8在海馬的能量供應起著主要的調節作用，明確GLUT8 的生理功能和調節機制可能對神經退行性疾病的研究有著重要意義。目前對于大腦中GLUT8的生理功能和調節機制的研究較少，因此利用生物信息學技術對GLUT8 進行分析和預測，有助于對GLUT8 在大腦的生理功能和調節機制進行研究。

在過去的幾十年中，使用高通量技術研究分子生物學系統已改變了生物學和生物醫學的研究，使研究人員能夠系統的研究生物體的基因組（基因組學）、一組RNA 分子（轉錄組學）和一組蛋白質，以及其結構和功能（蛋白質組學）[19]。因大多數生理和病理過程都表達在蛋白質水平上，現已開發了很多公開可用的數據庫和資源，以支持與蛋白質相關的信息管理和生物學知識的發現，可幫助研究人員快速尋找研究蛋白的相關信息學資源，為科研研究提供便利。本研究選取了一些常用的數據庫和資源對GLUT8 的蛋白特性、糖基化位點、磷酸化位點、與蛋白的二元相互作用及有相互作用的蛋白進行了預測，結果顯示GLUT8 蛋白由SLC2A8 編碼，位于9q33.3；全長10 759 bp，包含11 個外顯子，共477個氨基酸。GLUT8 為不穩定疏水性蛋白，無信號肽，有12 個跨膜區域，二級結構以α-螺旋為主，定位于細胞膜和細胞質中。蛋白質的糖基化參與多個生物過程，影響蛋白特性，而有的蛋白需要糖基化才能正常的折疊和在細胞內穿行[20]。本研究結果發現，GLUT8 有6 個糖基化位點，有利于其與不同底物結合，并攜帶底物在胞內遷移。GLUT8 磷酸化修飾主要參與細胞的信號轉導，對蛋白的活性和功能有重要的影響。本研究預測GLUT8 具有24 個磷酸化位點，推測其可能有多個作用位點和參與多條信號通路。現已確定的磷酸化位點為AMPK[21]，其他的磷酸化位點尚未見到報道。此外，預測的GLUT8 與46 個蛋白有二元相互作用，與10 個蛋白有相互作用，以上結果為進一步研究GLUT8 在腦內的生理功能和調節機制提供了理論依據。

綜上所述，GLUT8 為12 次跨膜蛋白，有多個糖基化位點和磷酸化位點，與多個蛋白相互作用，參與多條信號通路。