具有吸附重金屬鉛能力乳酸菌的安全性評價(jià)

張亮，于哲，張慧敏，賀銀鳳

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特 010018)

0 引言

重金屬鉛污染與人類活動有密切的關(guān)系[1]。環(huán)境中的鉛自發(fā)降解緩慢[2]，通過植物與動物間接進(jìn)入人體[3]。進(jìn)入人體的鉛易蓄積且不易排出，長期對人體生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等產(chǎn)生損傷[4]。考慮到鉛對環(huán)境和人體的危害，需要采取措施將環(huán)境和人體中的鉛移除[5]。過去常采用物理化學(xué)法去除鉛，因其效率低下、價(jià)格高昂、操作繁瑣逐漸被微生物修復(fù)法所替代[6]。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌胞壁的成分在其吸附重金屬方面有著關(guān)鍵的作用[7]。因此，深入發(fā)掘具有吸附鉛能力且安全的乳酸菌，并利用其去除食品、水、動物飼料中的重金屬，一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[8]。

乳酸菌多分布于人與動物腸道中，它們可以調(diào)節(jié)人與動物腸道的菌群結(jié)構(gòu)和生理功能，同時(shí)，一部分乳酸菌還有治療腹瀉、增強(qiáng)免疫力、降血壓、治療抑郁、抗腫瘤等保健和醫(yī)療作用[9]。乳酸菌有悠久的使用歷史一向被認(rèn)為是安全的，但一些研究結(jié)果表明，乳酸菌可能侵染宿主，使宿主產(chǎn)生不良的反應(yīng)，嚴(yán)重者甚至危及生命，例如乳酸桿菌存在宿主免疫低下時(shí)使其患病的風(fēng)險(xiǎn)[10]。部分乳酸菌擁有硝基還原酶或氨基酸脫羧酶，使其代謝活動產(chǎn)生具有致癌作用生物胺和亞硝基類化合物[11]。隨著傳統(tǒng)發(fā)酵食品中乳酸菌負(fù)面報(bào)道日益增加，采用單一抗生素治愈變得愈發(fā)困難，發(fā)酵食品中微生物的耐藥性越來越引起人們的重視[12]。出于人道主義角度，試驗(yàn)菌株在進(jìn)行體外安全性評價(jià)確認(rèn)在外部環(huán)境下是安全可靠后，方可進(jìn)行體內(nèi)評價(jià)程序。本文通過體外與體內(nèi)結(jié)合的方法，較系統(tǒng)的對實(shí)驗(yàn)室前期分離的乳酸菌進(jìn)行安全性評價(jià)，為生產(chǎn)安全健康的具有吸附重金屬鉛能力的菌粉產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)為實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

健康昆明小鼠，內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究中心，清潔級，體重(20±2)g。

1.1.2 菌株

戊糖片球菌10-a-1、9-b-1、F-e-3、F-f-3與海氏腸球菌Qaa，分離自內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市白云礦區(qū)；大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923，植物乳桿菌CICC6238、甲型溶血鏈球菌BNCC102663，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品生物技術(shù)團(tuán)隊(duì)保存。

1.1.3 儀器與材料

吲哚脫羧酶肉湯培養(yǎng)基、硝酸鹽還原酶肉湯培養(yǎng)基、氨基酸脫羧酶肉湯培養(yǎng)基、兔血瓊脂平板，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌提基因組試劑盒、小型質(zhì)粒提取試劑盒、Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、DL20000 DNA Marker、6×Loading buffer、Gel View核酸染料，北京博邁德科技發(fā)展有限公司；D/L-乳酸檢測試劑盒，愛爾蘭Megazyme公司；粘蛋白，Sigma-Aldich；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；2 mL一次性真空采血管，石家莊康衛(wèi)仕醫(yī)療器械有限公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌對鉛吸附能力測定

菌株對鉛吸附能力測定參照文獻(xiàn)[13]方法，將實(shí)驗(yàn)室前期篩選的5株乳酸菌活化三代后，離心(4 000 r/min,10 min)獲得菌體，經(jīng)超純水洗滌3次后，制成50 g/L（濕重）的菌懸液。在48孔方形深孔板中加入1.4 mL的鉛離子水溶液(50 mg/L,pH6.5)，加入菌懸液，使鉛離子水溶液中的菌體終濃度達(dá)到5 g/L。利用深孔搖床培養(yǎng)器振蕩(37℃,800 r/min)60 min，取吸附液離心(14 000 r/min,5 min)獲得上清液，使用火焰原子吸收分光光度計(jì)測定其中鉛離子含量。進(jìn)行2次平行3次重復(fù)試驗(yàn)。取50 mg/L的鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成濃度為0、10、20、30、40、50 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用火焰原子吸收分光光度計(jì)測定其對應(yīng)吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液的濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并求出吸光度值與濃度關(guān)系的一元線性回歸方程。于測定標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液相同條件下，測定吸附后上清液的吸光度值。代入標(biāo)準(zhǔn)系列的一元線性回歸方程中求樣品中鉛離子的含量，平行測定3次。鉛的吸附率和單位質(zhì)量菌體對鉛的吸附量的計(jì)算方法分別如下所示：

其中M0代表初始溶液中鉛離子的含量(mg)；M1代表吸附后溶液中鉛離子的含量(mg)；m代表添加的乳酸菌菌體量(g)。

1.2.2 生長曲線測定

菌株生長曲線測定參考文獻(xiàn)[14]方法，稍作修改，將活化好的菌液按照2%接種量至MRS液體培養(yǎng)基中每過2 h使用紫外分光光度計(jì)測595 nm處吸光值，同時(shí)梯度稀釋后涂布在MRS固體培養(yǎng)基上。持續(xù)48 h后，繪制OD595與活菌數(shù)對數(shù)值生長曲線。

1.2.3 菌株的安全性評價(jià)

（1）有害代謝產(chǎn)物試驗(yàn)。將活化至2代的乳酸菌與質(zhì)控菌株用生理鹽水洗滌3遍后，調(diào)OD595值至1，再按照2%接種量分別接種到含有賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸的肉湯培養(yǎng)基中，37℃，培養(yǎng)3 d，滴加指示劑呈現(xiàn)黃色為陰性，紫色為陽性。

(2)吲哚試驗(yàn)。將活化至2代的乳酸菌與質(zhì)控菌株用生理鹽水洗滌3遍后，調(diào)OD595值至1，再按照2%接種量接種至吲哚肉湯培養(yǎng)基中，37℃，培養(yǎng)3 d，先滴入5～10滴乙醚，再緩慢滴入靛基質(zhì)試劑，陰性乙醚層不變色，陽性乙醚層變?yōu)榘导t色。

(3)硝酸鹽還原酶。將活化至2代的乳酸菌與質(zhì)控菌株用生理鹽水洗滌3遍后，調(diào)OD595值至1，再按照2%接種量接種至硝酸鹽肉湯中，37℃，培養(yǎng)5 d，先加入硝酸鹽還原試劑甲液再加入乙液，陰性為淡粉色，陽性為暗紅色。

(4)D-乳酸檢測。將活化至2代的乳酸菌用生理鹽水洗滌3遍后，調(diào)OD595值至1，再按照2%接種量接種至脫脂乳培養(yǎng)基中，37℃，培養(yǎng)7 d后稱取1 g脫脂乳，按照D/L-乳酸檢測試劑盒進(jìn)行操作。

(5)溶血試驗(yàn)。溶血試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[15]中報(bào)道的方法，稍作修改，將活化至2代的乳酸菌與質(zhì)控菌株甲型溶血鏈球菌為α-溶血、金黃色葡萄球菌為β-溶血、植物乳桿菌為γ-溶血，用生理鹽水洗滌3遍后，調(diào)OD595值至1，再用接種環(huán)至5%兔血血瓊脂平板，37℃，培養(yǎng)2 d觀察結(jié)果。

(6)乳酸菌藥物敏感試驗(yàn)。藥物敏感試驗(yàn)參考美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會中對細(xì)菌進(jìn)行的方法[16]。選取常見的8種藥敏紙片，包括鏈霉素、諾氟沙星、萬古霉素、四環(huán)素、慶大霉素、青霉素G、阿莫西林和紅霉素，采用藥敏紙片擴(kuò)散法進(jìn)行細(xì)菌藥物敏感試驗(yàn)。以大腸桿菌ATCC25922，金黃色葡萄球菌ATCC25923作為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌。取100μL菌液分別涂布于MRS固體培養(yǎng)基平板上，待菌液被培養(yǎng)基完全吸收后，將藥敏紙片按照合適的位置貼入平板內(nèi)，靜置5 min后，37℃，培養(yǎng)24 h后，測量并記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑大小。

(7)質(zhì)粒檢測。乳酸菌質(zhì)粒檢測參考文獻(xiàn)[17]中報(bào)道的方法，將活化至2代的乳酸菌與質(zhì)控菌株，取3 mL，使用博邁德質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。提取步驟參照說明書。提取樣品用瓊脂糖凝膠電泳檢測，以含有質(zhì)粒的大腸桿菌ATCC25922為對照。

1.2.4 急性毒性試驗(yàn)

將適應(yīng)環(huán)境的健康昆明小鼠，分為2組，每組10只，雌雄各半，分別是對照組，戊糖片球菌10-a-1組。對照組用0.85%的生理鹽水灌胃，試驗(yàn)組采用1.2.5.1灌胃菌液的制備方法制得菌液經(jīng)口灌胃。灌胃前1天小鼠禁食16 h，自由飲水，灌胃后1、3、5、7 d記錄小鼠體重變化，每天采食量，一般表現(xiàn)、行為及中毒表現(xiàn)。一般表現(xiàn)、行為及中毒表現(xiàn)主要包括行為、動作、各種刺激反應(yīng)、瞳孔大小、鼻孔、呼吸、糞便硬度顏色、皮毛、眼球、姿勢等。

（1）灌胃菌液的制備。本實(shí)驗(yàn)按照GB 15193.3-2014[18]的規(guī)定中的上-下法執(zhí)行，灌胃劑量采用默認(rèn)計(jì)量梯度系數(shù)為3.2，高劑量組為2 mg/（g·BW）。取戊糖片球菌10-a-1在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至第二代，將培養(yǎng)至穩(wěn)定期的菌液8 000 r/min 4℃離心5 min，棄上清液，留下菌泥再用0.85%濃度的生理鹽水洗滌2遍。將戊糖片球菌10-a-1菌泥真空凍干測菌泥水分含量70%左右，所得濕菌泥的高劑量為6.667 mg/（g·BW）。灌胃溶劑采用0.02 mL/（g·BW）小鼠體重的0.85%生理鹽水，將濕菌泥溶于0.85%生理鹽水中。

（2）小鼠生產(chǎn)性能、臟器指數(shù)試驗(yàn)。小鼠生產(chǎn)性能是將小鼠適應(yīng)環(huán)境后正式開始試驗(yàn)時(shí)第1 d的初始體重以及第7 d體重記錄，并每日記錄小鼠的攝食量。臟器指數(shù)將小鼠脫頸處死后，取心、肝、脾和腎用0.85%生理鹽水涮洗血漬，放到擦鏡紙上吸干水分，進(jìn)行稱重并記錄。

（3）小鼠血液生化指標(biāo)。將急性毒性試驗(yàn)小鼠乙醚麻醉后摘眼球取全血于EDTA抗凝管中，3 500 r/min、10 min，檢測血清中的酶采用測定試劑盒，包括谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶。

（4）腸黏膜組織學(xué)檢查。將急性毒性試驗(yàn)中對照組與試驗(yàn)組的小鼠回腸，盲腸，結(jié)腸取2 cm，用生理鹽水將腸道內(nèi)容物清理后，放入4%多聚甲醛固定液中，送往愛博試劑公司進(jìn)行切片，采用蘇木精-伊紅染色用光學(xué)顯微鏡上的目鏡測微計(jì)測量形態(tài)學(xué)參數(shù)。記錄上皮細(xì)胞高度、絨毛高度、隱窩深度和黏膜厚度;每個(gè)樣本的每個(gè)參數(shù)隨機(jī)進(jìn)行10次測量，并將這些測量值的平均值用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)組內(nèi)組間重復(fù)3次，采用SPSS23.0和One-Way（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸附重金屬鉛乳酸菌基礎(chǔ)測定

2.1.1 乳酸菌對鉛吸附能力的測定

將課題組前期從包頭白云礦區(qū)和包鋼礦區(qū)分離篩選的5株益生特性好的乳酸菌，在其最適生長環(huán)境下進(jìn)行重金屬鉛吸附試驗(yàn)，10-a-1、F-e-3、F-f-3、9-b-1與Qaa對鉛的吸附率分別為87.73%±1.18%、83.67%±2.14%、85.77%±1.85%、90.10%±0.85%、70.95%±3.18%。與李暢研究的乳酸菌吸附效果基本一致[19]。

2.1.2 生長曲線測定

在進(jìn)行有害代謝產(chǎn)物試驗(yàn)時(shí)，常使用比濁法進(jìn)行供試菌液制備，由于測定的是濁度，把活菌與死菌都估算在內(nèi)，無法準(zhǔn)確估量衰退期，而平板菌落計(jì)數(shù)法能夠真實(shí)準(zhǔn)確的反映活菌數(shù)的動態(tài)變化增加實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度。在這里選用了活菌數(shù)與OD595值結(jié)合制作生長曲線。選擇37℃，pH 6.5測定5株乳酸菌生長曲線，其生長狀況如圖1所示，在0～2 h，F(xiàn)-f-3處于延滯期，在2～8 h，Qaa、F-f-3和10-a-1處在對數(shù)生長期，在2～10 h時(shí)9-b-1和F-e-3處在對數(shù)生長期，隨后5株菌都進(jìn)入穩(wěn)定期，在24 h后開始進(jìn)入衰亡期。在各株菌活菌數(shù)到達(dá)1.5×108時(shí)OD595值大約為1。

圖1 乳酸菌的生長曲線

2.2 菌株的安全性評價(jià)

2.2.1 有害代謝產(chǎn)物試驗(yàn)

乳酸菌酶種類多且活力高，參與宿主的多種生命活動，但在此過程中一部乳酸菌能產(chǎn)生吲哚、亞硝酸鹽、有害胺類化合物和D-乳酸等代謝廢物會對宿主健康產(chǎn)生威脅，從而引起了廣泛的關(guān)注。

色氨酸作為人體的必需氨基酸，在人體發(fā)揮著重要作用，如調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)消化和改善睡眠等。如果代謝發(fā)生障礙會引起腸道炎癥、統(tǒng)合失調(diào)和癌癥等[20]。5株乳酸菌經(jīng)試驗(yàn)，其代謝產(chǎn)物無吲哚類物質(zhì)。

硝基還原酶是一類依賴于黃素單核苷酸或黃素腺嘌呤二核苷酸的細(xì)胞質(zhì)酶，可利用NAD(P)H實(shí)現(xiàn)硝基芳香族化合物和硝基雜環(huán)衍生物的還原代謝。硝基還原酶能將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽攝入過量會導(dǎo)致頭暈頭痛，嚴(yán)重時(shí)可能導(dǎo)致生命危險(xiǎn)。并且已經(jīng)有乳桿菌和雙歧桿菌具有硝基還原酶活性的報(bào)道。5株乳酸菌經(jīng)試驗(yàn)，沒有發(fā)現(xiàn)硝基還原酶的存在。

氨基酸脫羧酶能將精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸代謝成為有害的鯡精胺、尸胺和腐胺，對人的神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等產(chǎn)生不利的影響，從而引起了廣泛的關(guān)注。本研究將5株乳酸菌進(jìn)行了氨基酸脫羧酶活性檢測。結(jié)果顯示，10-a-1、F-f-3與9-b-1無脫羧能力，Qaa與F-e-3有將精氨酸脫酸還原為鯡精胺能力。許女等人對老陳醋中篩選的20株乳酸菌進(jìn)行了氨基酸脫羧酶活性檢測試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)5株菌具有將鳥氨酸脫羧還原成腐胺的能力[21]。

乳酸根據(jù)旋光性的不同，分為L-乳酸和D-乳酸兩種。由于人體內(nèi)只有代謝L-乳酸的酶，若攝人過量的D-乳酸，則會引起代謝紊亂甚至酸中毒。正常機(jī)體對少量的D-乳酸不會產(chǎn)生明顯的不適感，但對短腸綜合征人群和通過手術(shù)減肥的人群則會引起D-乳酸血癥、昏迷及腸道不適，隨著減肥手術(shù)的普及這種代謝紊亂疾病可能會更加常見[22]。本研究將5株乳酸菌進(jìn)行了D-乳酸檢測，發(fā)現(xiàn)Qaa、F-e-3、F-f-3會產(chǎn)生微量的D-乳酸。

2.2.2 溶血試驗(yàn)

溶血活性試驗(yàn)是探究細(xì)菌致病機(jī)理常采用的研究方法，根據(jù)Ji等人的研究表明，溶血活性試驗(yàn)是通過將純化后的培養(yǎng)物劃線在添加5%脫蛋白羊血的瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行的[23]。試驗(yàn)采用甲型溶血鏈球菌為α-溶血質(zhì)控，金黃色葡萄球菌為β-溶血質(zhì)控，植物乳酸菌為γ-溶血質(zhì)控。對比5株試驗(yàn)菌株，9-b-1有β-溶血能力，其余4株為γ溶血。Arellano Karina等人對15株植物乳桿菌進(jìn)行溶血試驗(yàn)后結(jié)果表明其中從昆蟲、綠茶、泡菜分離的共5株產(chǎn)生了α-溶血[24]。

圖2 溶血試驗(yàn)結(jié)果

表1 有害代謝產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 藥物敏感試驗(yàn)與耐藥基因轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)

隨著抗生素的研發(fā)和濫用，多重抗藥的細(xì)菌和致病菌大量出現(xiàn)，給醫(yī)療體系增加了救治難度，對人體健康帶來了巨大的隱患。乳酸菌一直是公認(rèn)的對人類安全的細(xì)菌。乳酸菌中出現(xiàn)抗藥性本身沒有危險(xiǎn)，而且是有利的，因?yàn)樗茉黾尤樗峋挚弓h(huán)境脅迫的能力，增強(qiáng)其對環(huán)境的適應(yīng)性。近年來，大量深入的研究表明，許多乳酸菌抗性基因能在乳酸菌之間甚至是在乳酸菌與病原菌之間進(jìn)行傳播。同時(shí)一些研究還指出了抗性基因是由質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的，則水平基因轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)比內(nèi)在抗性基因在染色體上編碼時(shí)高[25]。因此，對乳酸菌抗藥性及抗藥基因的轉(zhuǎn)移性的研究是很有必要的。本試驗(yàn)對5株乳酸菌和2株質(zhì)控菌株進(jìn)行了8種抗生素的藥物敏感試驗(yàn)，在質(zhì)控合格是得出結(jié)果，5株乳酸菌對紅霉素都是中度敏感，對其余7種抗生素都顯示耐藥。同時(shí)，在檢測有無耐藥基因轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，顯示5株乳酸菌均不含有耐藥質(zhì)粒，即不攜帶有可轉(zhuǎn)移到耐藥基因。

表2 耐藥性實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果

圖3 質(zhì)粒提取電泳

2.3 急性毒性試驗(yàn)

在毒理學(xué)試驗(yàn)中，受試動物的進(jìn)食量、體重變化以及臟器與體重的比值通過與生理鹽水組的比較，可以反映出受試物對動物機(jī)體的影響，可以作為評價(jià)受試物毒性的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)對昆明小鼠采用質(zhì)量濃度為6.667 mg/（g·BW）的戊糖片球菌10-a-1菌泥進(jìn)行經(jīng)口灌胃，陰性對照組采用0.85%生理鹽水灌胃。1、3、5、7 d一般行為觀察顯示試驗(yàn)組小鼠行為正常、皮毛光澤、糞便等均正常，與陰性對照組的小鼠一般行為無差異。

2.3.1 小鼠生產(chǎn)性能試驗(yàn)

由表3可以看出，在小鼠生產(chǎn)性能試驗(yàn)中，雌雄小鼠在適應(yīng)環(huán)境后的稱重，體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，當(dāng)采用最大灌胃劑量經(jīng)口灌胃后，第7 d稱重時(shí)因?yàn)樾詣e差異，雌雄小鼠的末重與平均采食量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，但進(jìn)行同性別的試驗(yàn)組與對照組比較時(shí)，雌雄小鼠在末重與平均日采食量上是無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，表明戊糖片球菌10-a-1，對小鼠無毒。

表3 小鼠生產(chǎn)性能試驗(yàn)(x±sd，n=5)

2.3.2 小鼠臟器指數(shù)分析

由表4可以看出，在急性毒性試驗(yàn)中同性小鼠試驗(yàn)組與對照組的心、肝、脾和腎是無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的(P＞0.05)，雌性小鼠的腎體比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)是因?yàn)樾詣e導(dǎo)致，由小鼠臟器指數(shù)分析表明戊糖片球菌10-a-1，對小鼠無毒。

表4 小鼠臟器指數(shù)分析表(±sd,n=5)

表4 小鼠臟器指數(shù)分析表(±sd,n=5)

注：同行數(shù)據(jù)字母相同表示無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），不同字母表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

雄性 雌性試驗(yàn)組 對照組 試驗(yàn)組 對照組心體比 0.0066±0.0006a 0.0060±0.0005a 0.0056±0.0007a 0.0061±0.0011a腎體比 0.0166±0.0022a 0.0161±0.0010a 0.0131±0.0029b 0.0132±0.0011b脾體比 0.0059±0.0052a 0.0052±0.0044a 0.0056±0.0023a 0.0054±0.0004a肝體比 0.0493±0.0073a 0.0518±0.0047a 0.0497±0.0147a 0.0503±0.0078a項(xiàng)目

2.3.3 小鼠血液生化指標(biāo)

由表5可以看出，雌雄小鼠試驗(yàn)組與對照組血液生化指標(biāo)中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，因?yàn)楣缺D(zhuǎn)氨酶與谷丙轉(zhuǎn)氨酶是反應(yīng)肝臟受損程度的兩個(gè)指標(biāo)，說明單次高劑量灌入戊糖片球菌菌液對小鼠無毒害作用。同時(shí)反應(yīng)肝臟受損程度的輔助指標(biāo)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶顯示試驗(yàn)組與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，更進(jìn)一步說明，受試物對小鼠肝臟無毒副作用。

表5 小鼠血清生化指標(biāo)分析表(±sd,n=5)

表5 小鼠血清生化指標(biāo)分析表(±sd,n=5)

注：同行數(shù)據(jù)字母相同表示無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），不同字母表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

雄性 雌性試驗(yàn)組 對照組 試驗(yàn)組 對照組谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT/（U·L-1）項(xiàng)目20.87±4.55a 18.55±3.95a 19.34±4.07a 19.83±4.08a谷草轉(zhuǎn)氨酶AST/（U·L-1）43.35±5.66a 41.79±4.11a 40.68±6.68a 37.12±5.08a γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶/（U·L-1）37.76±3.3a 33.67±4.65a 34.04±3.49a 35.24±3.7a

2.3.4 腸黏膜組織學(xué)檢查

由表5可以看出，在回腸的黏膜高度、厚度和上皮細(xì)胞高度中，試驗(yàn)組與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，在盲腸的黏膜厚度和上皮細(xì)胞高度中，試驗(yàn)組與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，在結(jié)腸的黏膜厚度和上皮細(xì)胞高度中，試驗(yàn)組與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，證明戊糖片球菌10-a-1不會對小鼠腸道產(chǎn)生炎癥和分解黏蛋白能毒副作用，可以看出其對小鼠腸道是安全的。

表6 乳酸菌對腸道形態(tài)的影響(x±sd,n=5)

3 結(jié)論

將5株乳酸菌前期進(jìn)行吸附鉛能力測定與生長曲線測定，為后續(xù)安全性評價(jià)做鋪墊。在乳酸菌生長繁殖過程中，菌株會產(chǎn)生多種酶來輔助其生命活動，但例如色氨酸分解酶、硝酸鹽還原酶、氨基酸脫羧酶等會使其產(chǎn)生的有害代謝物，如果超過一定閾值，將對人體有害[26]。還有一些具有溶血能力酶的存在使血細(xì)胞破裂進(jìn)而導(dǎo)致人體發(fā)生溶血現(xiàn)象[27]。由5株乳酸菌進(jìn)行安全性評價(jià)程序可知，在有害代謝產(chǎn)物試驗(yàn)中，Qaa與F-e-3有將精氨酸脫酸還原為鯡精胺能力，發(fā)現(xiàn)Qaa、F-e-3、F-f-3會產(chǎn)生微量的D-乳酸。在溶血活性試驗(yàn)中，9-b-1有β-溶血能力。隨著抗生素被人類大量使用，導(dǎo)致世界范圍內(nèi)耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)，為感染性疾病的治療帶來了巨大的難題，細(xì)菌抗藥性研究引起了世界范圍內(nèi)學(xué)者的關(guān)注，同時(shí)有些乳酸菌攜帶有可轉(zhuǎn)移的耐藥基因的遺傳物質(zhì)，乳酸菌自身攜帶耐藥性沒有危險(xiǎn),但是有些有轉(zhuǎn)移耐藥基因轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的乳酸菌可能會成為致病原[28]。5株乳酸菌在對常見抗生素藥物敏感試驗(yàn)中，對紅霉素都是中度敏感，對其余7種抗生素都顯示耐藥，并且無質(zhì)粒，顯示出5株乳酸菌有較好的抵抗環(huán)境脅迫能力，同時(shí)無耐藥基因轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。急性毒性試驗(yàn)是毒理學(xué)試驗(yàn)最基礎(chǔ)也是最重要的一階段，該試驗(yàn)方法不僅可以直接觀察到受試物對生物體的傷害程度，還能為后續(xù)試驗(yàn)劑量提供參考價(jià)值[29]。通過體外安全性評價(jià)試驗(yàn)篩選出的安全性最高的戊糖片球菌10-a-1在急性毒性試驗(yàn)中，從小鼠生產(chǎn)性能、臟體比、血清生化指標(biāo)與腸道形態(tài)看，進(jìn)一步說明菌株是無毒副作用的。因乳酸菌具有的菌株特異性，對他們進(jìn)行安全性評價(jià)十分必要，也為實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供了好的理論基礎(chǔ)。