酶法降解奶垢工藝研究

林智偉，常甜甜，周英

（華東理工大學生物工程學院，上海200237）

0 引言

在乳制品的生產和加工中，超高溫瞬時滅菌（UHT）等超高溫設備及管壁不可避免地殘留部分乳制品。殘留的乳制品以蛋白質、脂肪、無機鹽和糖類等成分在設備上沉積結垢[1]。乳制品是微生物的良好養分，結垢污染物將導致細菌沉積并成為微生物滋生地[2]，影響牛奶及其他乳制品的質量安全[3]。為避免食物性疾病發生[4]，乳制品生產設備的衛生情況尤其重要。

傳統的乳制品污垢清洗工藝選擇常規的化學原料作為主要清潔成分。酸堿清洗劑的價格低廉且操作簡便，但存在許多缺陷[5]。燒堿使用不當會灼傷操作人員，與水溶液里的Ca2+、Mg2+容易產生沉淀，在管道內形成水垢增加清洗難度，并且會腐蝕設備中的橡膠類零件，減少使用壽命[6]。磷酸和硝酸使用頻率較高、清洗效果較好，但易殘留，加熱條件下的PO43-破壞牛乳的鈣鹽平衡產生白色沉淀。硝酸易揮發形成腐蝕性酸霧。次氯酸鈉等氯化物具有良好的殺菌和消毒效果，但次氯酸鈉中的Cl-會點蝕不銹鋼設備，長時間使用甚至發生管道穿孔。如今的洗滌劑行業面臨清洗排放后的工業用水變成破壞環境的高酸堿度廢水及傳統單一成分的清潔劑不能達到祛污需求等問題[7]。而在清潔劑中加入酶制劑等新工藝的發展，極大改善了清潔劑的除污力和清潔效能[8]。生物酶具有高效催化率，添加到清洗劑中可以增強不同污跡的祛污性[9]，還能提高環境安全性[10]。如今微生物產酶已實現工業化，大量的研究也改善了酶制劑的耐堿、耐熱性能，加酶洗滌劑的安全性也得到證明。

本研究在酪蛋白和乳清蛋白（WPC）模型流體的基礎上[11-17]，加入模擬牛奶濾液（SMUF）[18]制備模擬奶垢代替超高溫設備管道中的奶垢，解決工廠管道奶垢性質不穩定，不同生產批次成分差異明顯的問題。通過酶制劑和堿性鹽及NaOH溶液進行不同方式的復配，使用紫外光譜監測奶垢中蛋白質的降解效果[16]。探究在適宜的條件下，用可生物降解的酶制劑替代部分酸堿洗滌劑是有效且經濟可行的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

氫氧化鈉、酪蛋白、酪氨酸、四硼酸鈉、碳酸鉀、磷酸氫二鈉購自上海泰坦科技股份有限公司；三氯乙酸購自國藥集團化學試劑有限公司；磷酸二氫鉀購自永華化學科技（江蘇）有限公司；一水檸檬酸甲購自大連美侖生物技術有限公司；二水檸檬酸鈉、硫酸鉀、氯化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、乳糖購自上海凌峰化學試劑有限公司；二水氯化鈣購自北京索萊寶科技有限公司；六水氯化鎂購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；食品級酪蛋白、乳清蛋白購自河南譽州生物科技有限公司；氫氧化鈉溶液購自上海柯靈展新化工有限公司；堿性蛋白酶、脂肪酶、糖化酶，市售。

1.1.2 儀器與設備

FiveEasy Plus臺式pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)；HH-WO油浴鍋，河南予華；Synergy Mx酶標儀，美國伯騰；TA-XT2i質構儀，英國Stable Micro System；ZQLY-180N振蕩器，上海知楚；RR400Q101超純水制備系統，默克（上海）。

1.2 方法

1.2.1 模擬奶垢的制備

超濾液（SMUF）的配制調整如下:11.61 mmol/L KH2PO4、3.70 mmol/L K3C6H5O7·H2O、6.09 mmol/L Na3C6H5O7·2H2O、1.03 mmol/L K2SO4、2.17 mmol/L K2CO3、8.05 mmol/L KCl、8.98 mmol/L CaCl2·2H2O、3.21 mmol/L MgCl2·6H2O、24.0 g乳糖攪拌溶解并定容至480 mL。按照表1制備不同蛋白比例的模擬奶垢,置油浴鍋中于130℃加熱2 h，冷卻至室溫后于4℃冰箱保存使用。

表1 制備模擬奶垢配料表

1.2.2 模擬奶垢的質構測定

奶垢切成重量和形狀相近的長方體。質構儀的檢測前后速度為1 mm/s，壓縮程度為25%，探頭選擇P36。

1.2.3 堿性蛋白酶的活力測定

參照GB/T 23527-2009法，調整反應體積且將酶標儀作為檢測儀器。酪蛋白溶液使用前在40℃水浴鍋中預熱5 min。分別取1.0 mL酶液在適宜溫度中預熱2 min，空白組加入2.0 mL三氯乙酸，實驗組加入1.0 mL酪蛋白溶液。搖勻且在40℃水浴鍋中反應10 min后，空白組加入1.0 mL酪蛋白溶液，實驗組加入2.0 mL三氯乙酸，充分搖勻后靜置5 min，過濾。分別取1 mL濾液在275 nm波長下測定其吸光度。

1.2.4 模擬奶垢降解的測定

采用紫外光譜275 nm（蛋白質常用光譜250～320 nm范圍內的吸光度測量可準確方便地測定溶液中蛋白質濃度）和細菌濃度600 nm分別表示溶液中被降解的蛋白質濃度和上清液渾濁度。設NaOH溶液的降解效果為100%。

1.2.5 酶制劑與NaOH溶液的測定

根據工廠的管道清潔環境和實際情況[19-20]，設置溫度60℃，轉速75 r/min，時間40～60 min的恒溫搖床模擬管道清洗條件。NaOH溶液的濃度均為1.5%[21]。

（1）堿性蛋白酶與NaOH溶液混合降解。對照組為NaOH溶液，實驗組為NaOH溶液和堿性蛋白酶AKP-2不同方式的混合復配。堿性蛋白酶溶液酶活單位為200 U/mL。

（2）不同種類的酶制劑與NaOH溶液混合降解。對照組為NaOH溶液，實驗組為NaOH溶液和多種酶制劑以不同比例的混合復配。酶制劑溶液酶活單位為200 U/mL。

（3）堿性蛋白酶與堿性鹽溶液混合降解。對照組為NaOH溶液，實驗組分別為加入NaOH調整pH至10.5（堿性蛋白酶酶活最適pH）的NaHCO3和堿性蛋白酶AKP-2混合溶液以及Na2CO3和堿性蛋白酶AKP-2混合溶液。堿性蛋白酶溶液酶活單位為100 U/mL。

2 結果與討論

2.1 模擬奶垢的外觀和質構分析

如圖1所示，根據市售奶制品常見的3種蛋白比例制備的模擬奶垢，外觀顏色無明顯差異，主要呈現黃褐色海綿狀，與乳品廠中超過110℃形成的灰黃色奶垢外觀相近。這兩種蛋白性質不同，酪蛋白可支撐結構；乳清蛋白熱穩定差，易受高溫影響，因此酪蛋白和乳清蛋白影響奶垢的硬度和黏性[22-23]。

圖1 不同蛋白比例的奶垢外觀

由表2可知，酪蛋白比例越大，模擬奶垢硬度越大。其中兩種蛋白比例為8∶2制備的奶垢的硬度最大。UHT等超高溫乳制品生產加工設備產生的奶垢比實驗室環境中制備的模擬奶垢所需條件更加復雜，以硬度指標作為首要考慮因素，后續采取酪蛋白和乳清蛋白為8∶2的比例制備模擬奶垢。

表2 不同蛋白比例奶垢的質構測定結果

2.2 堿性蛋白酶的篩選

不同蛋白酶的酶活通常測定條件不同，需要在相同條件下篩選出酶活性高，熱穩定性好的堿性蛋白酶。如圖2所示，4種堿性蛋白酶在60℃的酶活測定，前3種酶制劑的活性較高，均超過1.8×105U/g，屬于耐高溫高堿酶制劑，AKP-4的酶活性低于5.0×103U/g。如圖3所示，堿性蛋白酶AKP-1、AKP-2、AKP-3在60℃，40 min內分別保留了83%、95%和93%的殘留活性。

圖2 堿性蛋白酶的酶活

圖3 堿性蛋白酶的熱穩定性

2.3 酶制劑與NaOH溶液的復配降解

商用清潔劑常含有表面活性劑、助劑及酶制劑等成分[24]。國外學者認為酶制劑和NaOH溶液共同作用，可將乳制品污染的膜恢復其滲透性[25]。

2.3.1 堿性蛋白酶和NaOH溶液混合降解

圖4和圖5顯示堿性蛋白酶AKP-2和NaOH溶液混合復配降解奶垢的效果。最高降解率可達到NaOH溶液降解效果的93%（OD275）和95%（OD600）。NaOH溶液單獨作用越久，奶垢的降解效果越好。堿性蛋白酶和NaOH溶液混合，導致蛋白酶在堿性環境中變性失活，部分NaOH溶液無法參與降解過程。一旦混合越久，不恰當的復配方式將弱化NaOH溶液和堿性蛋白酶的共同作用。雖然合理的復配方式可以降解奶垢，但部分復配方式中蛋白酶的活性受到NaOH溶液影響，降低了酶的利用率。

圖4 降解模擬奶垢的效率OD275

圖5 降解模擬奶垢的效率OD600

2.3.2 不同種類的酶制劑與NaOH溶液混合降解

由圖6和圖7可知，不同復配方式均達到不同的降解效果。最高降解率可達到NaOH溶液降解效果的92%（OD275）和93%（OD600）。模擬奶垢的主要成分是酪蛋白和乳清蛋白，堿性蛋白酶在蛋白降解中起到重要作用。但是酶制劑本質屬于蛋白，蛋白酶抑制其它酶制劑的活性，降低利用效率。未來考慮改變蛋白酶在洗滌劑中的情況，可為復合洗滌劑的開發提供更多思路。

圖6 降解模擬奶垢的效率OD275

圖7 降解模擬奶垢的效率OD600

2.3.3 堿性蛋白酶和堿性鹽混合降解

Na2CO3和NaHCO3對環境污染少且腐蝕性弱。NaHCO3溶液常用于清洗醫療器械中的脂肪蛋白等混合污垢，含水Na2CO3溶液在高溫下能清洗油污。添加Na2CO3和NaHCO3溶液可減少NaOH溶液使用量，從而提高堿性蛋白酶的利用率。

結果如圖8和圖9所示，NaHCO3和堿性蛋白酶AKP-2的復配降解效果僅達到NaOH溶液降解效果的59%（OD275）和65%（OD600），平均降解率為62%。NaHCO3通過軟化奶垢，減少其與設備的附著達到清洗效果，而NaOH溶液直接將奶垢中的蛋白質分子分解成小分子。在工廠設備中，奶垢與設備的黏著性越低越容易被清洗，雖然降解效果有待提高，但作為堿性助劑的NaHCO3溶液，在奶垢清洗劑的開發中十分具有前景。

圖8 降解模擬奶垢的效率OD275

圖9 降解模擬奶垢的效率OD600

Na2CO3洗劑常用于清除油脂和礦物鹽等。硬水中的礦物鹽和雜質在壁上形成難溶解物質而產生水垢，通過Na2CO3可以去除。Na2CO3和油脂反應后生成可溶于水的脂肪酸鹽。結果如圖10和圖11所示，Na2CO3和堿性蛋白酶AKP-2的復配降解效果達到純NaOH降解效果的69%（OD275）和79%（OD600），平均降解率為74%。CO32-比HCO3-更易水解，堿性更強，所以降解效果更好。

圖10 降解模擬奶垢的效率OD275

圖11 降解模擬奶垢的效率OD600

3 結論

研究結果證實，堿性蛋白酶等酶制劑和NaOH溶液復配可降解奶垢。通過添加堿性鹽NaHCO3和Na2CO3代替NaOH，與堿性蛋白酶混合復配降解奶垢。雖然目前該替代方案的降解效果未達到NaOH溶液的降解效果，但堿性鹽腐蝕少污染小的特性十分具有前景，為代替部分NaOH用量提供了可能。

但是在堿性蛋白酶和NaOH復配以及不同酶制劑復配中，部分方案的蛋白酶容易受到NaOH影響或者其余酶制劑活性受到蛋白酶影響。為提高降解效率，合理正確的復配工藝正成為未來研究方向。