正交優(yōu)化黃連多糖提取工藝及其對(duì)α-葡萄糖苷酶的作用研究

王長(zhǎng)鳳

黃連為毛茛科黃連屬植物黃連(CoptischinensisFranch)、三角葉黃連(CoptisdeltoidenC. Y. Cheng et Hsiao)或云南黃連(Coptisteetawall.)的干燥根莖，是臨床治療中常用的中藥材。黃連味苦，性寒，具有清熱祛濕、瀉火解毒的功效[1-3]。黃連多糖是黃連的重要活性成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)黃連多糖具有降血糖、抗氧化、抗病毒等生物活性作用[4-6]。

目前黃連多糖的提取方法多為水提取法，該方法簡(jiǎn)單、容易操作，但是其多糖提取率不高，容易造成多糖損失[7]。此研究利用超聲輔助提取黃連多糖，并對(duì)提取工藝進(jìn)行正交優(yōu)化，同時(shí)就黃連多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的作用進(jìn)行研究，以期為黃連的研究與開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

黃連購(gòu)買(mǎi)于河南省輝縣藥材市場(chǎng)，經(jīng)范勝蓮副主任中藥師鑒定為毛茛科植物黃連的根莖；α-葡萄糖苷酶(北京索萊寶科技有限公司)；4-硝基苯-α-D葡萄糖苷(PNPG，美國(guó)Sigma公司)；濃硫酸、苯酚等其它試劑為分析純。WF-萬(wàn)能粉碎機(jī)(江陰市康和機(jī)械制造有限公司)；CHG型超聲提取器 (德陽(yáng)四創(chuàng)科技有限公司)；紫外分光光度計(jì)UV7(梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司)。

2 方法

2.1 提取工藝流程采用超聲輔助提取法進(jìn)行黃連多糖的提取，并利用Sevage法除去蛋白質(zhì)，得到黃連多糖提取物，具體流程為：黃連→粉碎→過(guò)篩→石油醚回流脫脂脫色 3 次(1.5 h /次) →烘干→超聲輔助提取→抽濾→濾液減壓濃縮→5 倍體積 95% 乙醇沉淀12 h→6000 r/min 離心20 min→沉淀物→無(wú)水乙醇洗滌→水溶→Sevage法脫蛋白5次→冷凍干燥→多糖粗品[8]。

2.2 多糖含量測(cè)定稱(chēng)取葡萄糖對(duì)照品 50 mg，加水溶解定容至100 ml容量瓶中，備用。精密移取 0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml對(duì)照品溶液，定容于 50 ml容量瓶中。分別精密移取2 ml于試管中，分別加入1.0 ml 6%苯酚和5.0 ml濃硫酸混勻，靜置 10 min，冷卻至室溫，于 490 nm 處測(cè)定吸光度。以多糖含量(mg)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]。通過(guò)線性回歸得出方程為Y=12.312X-0.0351，線性范圍為0.005 ～0.05 mg/ml，相關(guān)系數(shù)為r=0.9998。

2.3 正交優(yōu)化超聲輔助提取工藝稱(chēng)取2.0 g黃連干粉若干份，分別選取液料比(15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 ml/g)、提取時(shí)間(20、30、40、50、60 min)、提取功率(60、70、80、90、100 W)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化黃連多糖提取工藝。見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2.4 黃連多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用及抑制機(jī)制反應(yīng)在96孔板上進(jìn)行，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照藥物[10]。測(cè)定組：112 μl磷酸緩沖液(pH=6.8)，加入0.2 U/ml的α-葡萄糖苷酶20 μl，二甲基亞砜8 μl，加入50μl的待測(cè)提取物，37 ℃恒溫孵育20 min后加入2 mmol/L PNPG 20 μl，37 ℃恒溫反應(yīng)15 min。再加入1 mol/L 碳酸鈉溶液100 μl終止反應(yīng)，于405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。同時(shí)做相同體系下，空白組：不加抑制劑和α-葡萄糖苷酶，其它條件與測(cè)定組相同；未加抑制劑測(cè)試組：不加抑制劑，其它條件與測(cè)定組相同；未加酶空白組：不加α-葡萄糖苷酶，其它條件與測(cè)定組相同。均用蒸餾水作空白，于405 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度值。樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制率公式如下：抑制率(%)=(A對(duì)照-A樣品)/(A對(duì)照-A空白)×100%。式中：A空白為空白對(duì)照組的吸光度值；A對(duì)照為未加樣品的吸光度值；A樣品為樣品組的吸光度值。并用SPSS 19.0軟件求出相對(duì)應(yīng)半數(shù)抑制濃度IC50。

2.5 黃連多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制類(lèi)型測(cè)定參照2.4項(xiàng)下方法，底物PNPG濃度依次為0.067，0.1，0.2，0.5和1.0 mmol/L。在多糖濃度分別為1 mg/ml和2 mg/ml時(shí)，記錄每分鐘PNP吸光度值，測(cè)定酶促反應(yīng)速度V。采用Lineweave-Burk作圖法，1/C為橫坐標(biāo)，1/V為縱坐標(biāo)，確定抑制類(lèi)型，式中C為底物PNPG濃度，V為酶促反應(yīng)速度，根據(jù)米氏方程計(jì)算動(dòng)力學(xué)常數(shù)[11]。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 液料比對(duì)多糖提取率的影響液料比對(duì)于多糖的提取具有十分關(guān)鍵的影響，液料比過(guò)大，可能造成多糖的提取率降低且其余雜質(zhì)也容易一起提取出來(lái)，從而影響多糖純度，加大后續(xù)純化的難度。若液料比過(guò)小，容易出現(xiàn)多糖提取不充分的情況。因此此實(shí)驗(yàn)在超聲功率90 W、提取時(shí)間30 min的條件下，考察液料比對(duì)黃連多糖提取率的影響。在料液比為15∶1～25∶1 ml/g時(shí)，黃連多糖提取率隨提取溶劑體積的增加而增大，當(dāng)液料比為25∶1 ml/g時(shí)，黃連多糖的提取率達(dá)到最大為5.31%；隨著溶劑體積繼續(xù)增加，多糖提取率降低。出現(xiàn)這種趨勢(shì)的原因可能是提取溶劑體積增大，多糖質(zhì)量濃度降低，傳質(zhì)推動(dòng)動(dòng)力變大，提取速度增加，提取率增大；當(dāng)溶劑體積繼續(xù)增加達(dá)到一定數(shù)值時(shí)，提取率緩慢降低，可能是因?yàn)橛写罅康碾s質(zhì)溶出，影響多糖浸出率[12]。見(jiàn)圖1。

圖1 液料比對(duì)多糖提取率的影響

3.1.2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響提取時(shí)間是影響多糖提取率的重要因素之一。若提取時(shí)間過(guò)短，容易出現(xiàn)多糖提取不充分的情況，造成資源的浪費(fèi)。若提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)導(dǎo)致多糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響多糖的提取率和穩(wěn)定性。因此，在超聲功率90 W、液料比30∶1 ml/g的條件下，觀察提取時(shí)間對(duì)黃連多糖提取率的影響。在20～40 min內(nèi)，多糖提取率隨提取時(shí)間增加而增大，在提取時(shí)間為40 min時(shí)，提取率最大為5.56%。當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)40 min后，多糖提取率逐漸下降，這可能是因?yàn)槌曒o助時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致黃連多糖的結(jié)構(gòu)受到破壞，進(jìn)而導(dǎo)致多糖提取率降低。見(jiàn)圖2。

圖2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

3.1.3 提取功率對(duì)提取率的影響超聲輔助功率在多糖提取過(guò)程中起到十分關(guān)鍵的作用，超聲輔助提取通過(guò)空穴效應(yīng)、熱效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)提高多糖的提取效率。若超聲功率過(guò)高，容易破壞多糖的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。若超聲功率過(guò)低，則起不到輔助提取的作用，進(jìn)而導(dǎo)致多糖提取率偏低的情況出現(xiàn)。因此，在液料比30∶1 ml/g、提取時(shí)間30 min的條件下，觀察提取功率對(duì)黃連多糖提取率的影響。在60～90 W內(nèi)，多糖提取率逐漸增加。當(dāng)功率大于90 W后由于超聲功率過(guò)高，多糖結(jié)構(gòu)受到破壞，不利于黃連多糖的提取[13]。見(jiàn)圖3。

圖3 提取功率對(duì)多糖提取率的影響

3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果選取的3個(gè)單因素對(duì)于黃連多糖提取率的影響順序?yàn)椋築(提取時(shí)間)>C(提取功率)>A(料液比)。黃連多糖提取最優(yōu)工藝參數(shù)為A2B3C3，即液料比40 ml/g，提取功率100 W，提取時(shí)間 30 min。采用優(yōu)化提取條件進(jìn)行工藝驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得多糖平均提取率為8.06%(n=3，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.89%，8.06%的提取率是根據(jù)最優(yōu)工藝參數(shù)為A2B3C3，即液料比為40 ml/g，100 W提取功率，30 min提取時(shí)間，進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)得到的平均值)，高于正交試驗(yàn)各組，說(shuō)明該工藝重復(fù)性較好。見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)方案與結(jié)果

3.3 抗氧化活性研究

3.3.1 阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用阿卡波糖是目前已上市的α-葡萄糖苷酶特異性抑制劑[14]。在不同濃度阿卡波糖作用下，阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用呈良好量效關(guān)系，說(shuō)明此實(shí)驗(yàn)α-葡萄糖苷酶體外抑制模型符合實(shí)驗(yàn)需要。見(jiàn)圖4。

圖4 阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性

3.3.2 黃連多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用及抑制機(jī)制黃連多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶有抑制作用，且在一定范圍內(nèi)隨著濃度的增加，其對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用也逐漸增強(qiáng)，黃連多糖的IC50為3.884 mg/ml。黃連多糖呈典型的競(jìng)爭(zhēng)性抑制曲線，即隨抑制劑濃度增加，反應(yīng)速度保持不變，說(shuō)明黃連多糖與α-葡萄糖苷酶底物在該酶上的結(jié)合部位是相同的[15]。見(jiàn)表3，圖5、圖6。

圖5 黃連多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性

圖6 黃連多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制動(dòng)力學(xué)

表3 黃連多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制擬合方程和動(dòng)力學(xué)參數(shù)

4 結(jié)論

此實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，合并正交試驗(yàn)優(yōu)化黃連多糖的提取工藝，結(jié)果表明黃連多糖提取的最佳工藝條件為液料比40 ml/g，提取功率100 W，提取時(shí)間30 min。采用優(yōu)化提取條件進(jìn)行工藝驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得多糖平均提取率為8.06%。提取的黃連多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性具有一定的抑制作用，且其抑制類(lèi)型呈典型的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。此實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得出的黃連多糖提取工藝及其對(duì)α-葡萄糖苷酶的作用，具有開(kāi)發(fā)為降糖藥巨大的市場(chǎng)前景，可為黃連的開(kāi)發(fā)與利用提供基礎(chǔ)。