短葶山麥冬莖尖愈傷組織的誘導與植株再生

袁玉虹，董 雯，孫 艷，何天友，鄭郁善cc

(1.福建林業職業技術學院，福建 南平 353000；2.福建農林大學，福建 福州 350002)

1 引言

短葶山麥冬(Liriopemuscari(Decn.)Bailey)收錄在2015年版的《中華人民共和國藥典》山麥冬名下[1]，為百合科山麥冬屬多年生草本植物，又名福建麥冬，主要分布在福建泉州低海拔地區，我國江蘇、安徽、浙江及廣西等省區均有分布[2]。短葶山麥冬是集藥用、食用、保健及觀賞于一身的園藝植物[3]，其藥用部位為干燥塊根，主要具有養陰生津，潤肺清心功效，在臨床上治療腫瘤、肺結核、便秘、失眠等疾病。

以山麥冬為原料各類保健飲品、藥品不斷被研制出來，麥冬的市場需求量上升趨勢明顯，而短葶山麥冬是國內主流商品麥冬類藥材，有效成分含量并不低于川麥冬，具有巨大的市場開發潛力。目前短葶山麥冬以播種繁殖和分蘗繁殖為主[3]，播種繁殖成苗時間長，出苗率低、性狀不穩定、易受季節限制等問題；分蘗繁殖效率慢、繁殖率低、性狀易退化等風險，這兩種方式均不利于短葶山麥冬作為工廠化生產種植的首選。組織培養可在不受外界環境條件的限制下實現快速大量繁殖種苗，且能較好地保持母本的優良性狀[4]，是實現短葶山麥冬工廠化育苗及良種推廣應用的關鍵技術。

目前國內關于麥冬的組織培養激素配比研究較多[5～8]，但不同的研究人員選用的激素種類、用量和組合不一樣，研究的結果也不盡相同。因此，本研究采用L9(34)正交試驗研究激素類型和濃度對短葶山麥冬愈傷組織誘導的影響，以提高其愈傷組織誘導率及其品質，為改良短葶山麥冬工廠化生產提供一定依據。

2 材料和方法

2.1 試驗材料

選用從泉州洛江區短葶山麥冬GAP基地移栽至福建農林大學福建省中藥材GAP工程技術研究中心苗圃的優良短葶山麥冬。

2.2 材料處理

選用長勢較好的短葶山麥冬植株莖尖，用肥皂水浸泡15 min去除植株表面附著物，然后將植株莖尖置于流水沖洗1 h后轉置超凈工作臺，用滅菌水沖洗3遍，用75%乙醇溶液消毒30 s后再用滅菌水沖洗3遍，然后置于0.1%升汞消毒劑中浸泡10 min，用滅菌水沖洗3遍。將消毒后的短葶山麥冬莖尖切取長度為5 mm的小段為外植體以備用。

2.3 愈傷組織誘導

將滅菌的外植體接種在以MS為基本培養基，添加不同植物生長調劑誘導愈傷組織。激素濃度配比采用L9(34)正交試驗設計(表1)，以2，4-D、6-BA、NAA 3個因子。其中培養基中瓊脂7 g/L，蔗糖濃度為30 g/L，pH值調至5.8。每個處理接種外植體30瓶，每瓶一個外植體，3次重復，30 d后統計愈傷組織生長情況及誘導率。

表1 愈傷組織誘導L9(34)正交試驗設計

2.4 愈傷組織繼代培養

選取生長狀況較好的愈傷組織接種在以MS為基本培養基，添加不同植物生長調劑進行繼代培養。激素濃度配比采用L9(34)正交試驗設計(表2)，以2，4-D、6-BA、NAA 3個因子。其中瓊脂7 g/L，蔗糖30 g/L，pH值5.8。每次20瓶，每瓶接種愈傷組織重量為0.2 g，45 d后統計出愈傷組織培養過程中的增殖系數。

表2 愈傷組織繼代培養L9(34)正交試驗設計

2.5 不定芽誘導

選取生長狀況較好的愈傷組織接種在以MS為基本培養基，添加不同濃度的6-BA+NAA 0.5 mg/L激素組合進行對不定芽誘導,6-BA濃度配比如表3。其中瓊脂7 g/L，蔗糖30 g/L，pH值5.8。每個處理接種20瓶，每瓶接種2～3個愈傷組織，3次重復，45 d后統計分化情況并計算誘導率。

2.6 數據分析

采用Excel和SPSS17.0進行數據計算和統計分析，并對結果進行多重比較。

3 結果與分析

3.1 不同激素配比對愈傷組織誘導的影響

短葶山麥冬外植體接種后，第9 d后開始長出愈傷，30 d后統計各處理的出愈率及愈傷生長狀況。由表4可見，激素配比組合5出愈率優勢明顯，達94.55%，且愈傷組織質量最佳(圖1)，其次是組合7，出愈率81.13%，愈傷組織質量中上。從表5方差分析看出，NAA和2,4-D對短葶山麥冬莖尖愈傷組織秀導率存在顯著影響。由極差分析結果表明，影響短葶山麥冬莖尖愈傷組織因素的激素主次順次為：2.4-D>NAA>6-BA，就出愈率而言最優組合為A2B1C3，即激素配比2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/LNAA的MS培養基誘導愈傷組織效果最佳。同時，從圖2可以得知，在一定范圍內，隨著2,4-D和NAA濃度的增加，愈傷誘導率呈先上升后下降的趨勢，可能高濃度的植物激素會抑制愈傷組織的形成；隨6-BA濃度的增加，愈傷誘導率呈逐漸遞減的趨勢。

表3 不定芽的誘導試驗設計

表4 不同激素配比對短葶山麥冬莖尖愈傷誘導率極差分析

表5 不同激素配比對短葶山麥冬莖尖愈傷誘導率方差分析

圖1 組合5愈傷組織誘導

3.2 不同激素配比對繼代增殖的影響

從表6可以看出，短葶山麥冬愈傷繼代增殖系數最高的處理為組合6，即1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/LNAA，增殖系數達到5.1，與組合5相比增殖系數差異不明顯顯著高于其他激素配比組合。從表7方差分析看出，2.4-D濃度和6-BA濃度對對短葶山麥冬愈傷組織繼代增殖系數的影響達到顯著水平(P<0.05)，由極差分析結果顯示，影響愈傷組織繼代增殖系數因素的激素主次順次為：2.4-D>6-BA>NAA，就增殖系數而言最優組合為A2B3C2，即激素配比1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/LNAA的MS培養基愈傷組織繼代培養效果最佳。2,4-D和6-BA濃度在一定范圍內，愈傷組織的增殖系數隨濃度的升高呈先上升后降低的趨勢，說明激素濃度過高或過低都不適合愈傷組織的繼代培養。NAA濃度在0～0.1 mg/L之間愈傷組織增殖系數無顯著變化。

圖2 不同激素因素水平與短葶山麥冬愈傷誘導率關系趨勢

表6 不同激素配比對愈傷組織繼代增殖培養極差分析

表7 不同激素配比對愈傷組織繼代增殖培養方差分析

3.3 不同6-BA濃度對愈傷組織不定芽分化的影響

由表8可知，不同濃度6-BA對短葶山麥冬愈傷組織再生的影響存在著明顯差異。出芽效果最好的為組合7，即6-BA濃度為4.0 mg/L時，短葶山麥冬愈傷組織不定芽增殖系數達到5.54，分化出叢生芽，苗高且葉粗(圖3)。6-BA濃度在1～8 mg/L范圍內，隨著6-BA濃度的增加，愈傷組織的分化呈先上升后下降的趨勢(圖4)。

表8 不同濃度6-BA對愈傷不定芽分化的影響

圖3 組合7不定芽分化狀況

圖4 不同濃度6-BA對不定芽分化的趨勢

4 結論與討論

植物激素是影響植物組織培養是否成功的關鍵因素[9]。在組織培養中基本培養基MS僅能保證外植體存活，要獲得優質的試管苗必須在基本培養基中添加植物生長調節劑。不同植物生長調劑的不同濃度配比對外植體生長和分化作用不同，如生長素類主要是誘導外植體產生愈傷組織和促進不定根的發生，細胞分裂素類常用來誘導不定芽的形成。

以短葶山麥冬莖尖為外植體，在愈傷組織誘導和繼代培養階段選用不同濃度配比2,4-D、NAA和6-BA。本試驗結果顯示愈傷組織誘導率最佳的激素配比為：2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/LNAA，出愈率達到94.55%，愈傷組織質地緊密，生長旺盛，質量最優。相關研究表明，2,4-D和NAA可顯著誘導愈傷組織形成[10～12]，與本研究結論一致。其中，2,4-D對愈傷組織的誘導影響最大，且濃度在0～2 mg/L范圍內，與愈傷組織生長呈正相關。

從愈傷組織中大量快速增殖是工廠化育苗快速繁殖一個重要途徑[13]。本試驗發現將2,4-D濃度降低至1.0 mg/L，激素配比為1.0mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/LNAA的繼代培養基上，短葶山麥冬愈傷組織凈增鮮重為1.08g，增殖系數達到5.1。萬學鋒[14，15]研究發現短葶山麥冬莖尖誘導產生的愈傷組織比較致密，不能滿足繼代增殖需要，必須改變培養基中激素配比，降低2,4-D的濃度能使愈傷組織細胞結構發生變化，與其研究結論一致。前人研究發現植株再生培養中6-BA對芽增殖起重要作用，且與低濃度的生長素配比可更有利于不定芽的形成[16，17]。在MS培養基中添加4 mg/L6-BA+0.5 mg/LNAA，不定芽增殖系數達到5.54，分化出叢生芽，苗高且葉粗，效果最佳，且當NAA濃度相同時，6-BA濃度在0～4 mg/L范圍內，與不定芽的形成呈正相關。