煙草早花相關(guān)基因ELF的生物信息學(xué)分析

吳俊林 郭傳濱 李 昂 姜 山 肖金勝 劉 哲 王瑞云 周權(quán)* 賈峰

（1河南省駐馬店市煙草公司泌陽(yáng)縣分公司，河南泌陽(yáng) 463700；2湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司襄陽(yáng)卷煙廠，湖北襄陽(yáng) 441000；3河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001）

已有研究表明，植物早花在擬南芥中主要存在6種成花途徑，即春化途徑、自主開花途徑、光周期途徑、赤霉素途徑、溫敏途徑及年齡途徑[1]。低溫及帶來(lái)的一系列生化反應(yīng)，可直接影響相關(guān)的成花基因（FT、SOC1、ELF 和 FLC），導(dǎo)致植物早花[2-3]。 另外，低溫可活化赤霉素[4]、茉莉酸[5]等信號(hào)通路，調(diào)控成花基因表達(dá)，導(dǎo)致植物早花；低溫還可誘導(dǎo)開花關(guān)鍵基因SOC1表達(dá)水平升高，導(dǎo)致植物早花[6]。

煙草早花是指煙株在未達(dá)到本品種特性或當(dāng)?shù)爻Ｄ暝耘鄳?yīng)有的高度和葉片數(shù)時(shí)就提前現(xiàn)蕾開花的現(xiàn)象。環(huán)境低溫作為影響煙草早花的非生物脅迫之一，移栽后若出現(xiàn)13～18℃的低溫并持續(xù)1周左右，即可誘導(dǎo)煙草早期開花基因的表達(dá)[6-7]。早期開花基因4（ELF4）被認(rèn)為是光周期感知和晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)的必需基因[8]，DhEFL4可能在花期調(diào)控中發(fā)揮重要作用。ELF4基因是生物鐘反饋回路的重要組成部分，失去該基因會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的時(shí)鐘損傷，植株在非誘導(dǎo)光周期下開花早[9]。ELF4在不同器官類型的時(shí)間表達(dá)存在差異，MeELF4在木薯的根、莖和花中表現(xiàn)為低表達(dá)[10]，DhEFL4基因在營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官均有表達(dá)[8]。早期開花基因3（ELF3）在擬南芥中是光周期開花和正常晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)所必需的基因，可能具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能[11]，引起擬南芥早花[12]。但是，在擬南芥和水稻中，基因AtELF3和OsELF3.1的調(diào)控作用是相反的[13]。蛋白ELF3是構(gòu)成ELF4和LUX之間復(fù)合物的必要和充分條件，該復(fù)合物在白天被調(diào)節(jié)，在黃昏達(dá)到頂峰[14]。此外，蛋白ELF3和ELF4還與染色質(zhì)重構(gòu)因子、組蛋白去乙酰化酶、轉(zhuǎn)錄因子等其他蛋白形成多種復(fù)合物，從而實(shí)現(xiàn)多種靶點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄抑制[15]。擬南芥的蛋白ELF3和ELF4是2個(gè)重要的信號(hào)樞紐，它們整合了環(huán)境光和溫度信號(hào)，調(diào)控植物的開花[16-17]。

煙草作為重要的經(jīng)濟(jì)作物和模式作物之一，早花現(xiàn)象容易導(dǎo)致煙株葉片數(shù)量減少，也會(huì)降低煙葉的品質(zhì)，從而影響煙農(nóng)的最終經(jīng)濟(jì)收入。目前，對(duì)普通煙草早花相關(guān)基因ELF表達(dá)及其蛋白特性的研究尚少。本研究通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)煙草早花基因及其蛋白理化特性進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，旨在為預(yù)防煙葉早花領(lǐng)域研究奠定基礎(chǔ)，為降低早花發(fā)生對(duì)煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量的影響提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)的獲取

分別在 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.arabidopsis.org/,V10.0）、茄科數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//solgenomics.net/）和煙草數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//nadh.ice.mpg.de/NaDH/）下載水稻、擬南芥、辣椒、番茄和煙草中與早花（early flowering）相關(guān)基因的DNA序列，利用ExPASy在線軟件（https：//web.expasy.org/translate/）Translate tool將 DNA 序 列翻譯成蛋白質(zhì)序列，選取Open reading frames比較長(zhǎng)和相對(duì)集中的翻譯序列。

1.2 早花相關(guān)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

采用 ExPASy在線軟件 ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)獲得的早花相關(guān)蛋白序列的等電點(diǎn)、分子量和脂肪族氨基酸指數(shù)等理化性質(zhì)進(jìn)行分析[18]。SignalP 網(wǎng)站（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）用于對(duì)煙草早花相關(guān)蛋白的信號(hào)肽進(jìn)行分 析 ，TMHMM 網(wǎng) 站 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）用于對(duì)煙草早花相關(guān)蛋白的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3 多序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

利用MEGA 6.0軟件將煙草、番茄、辣椒、擬南芥和水稻早花相關(guān)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列比對(duì)（http：//www.ebi.ac.uk/clustalw/），根據(jù)比對(duì)結(jié)果，采用Clustal Omega中的ClustalW模式構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 早花相關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

利用 MEME在線軟件（https：//meme-suite.org/meme/）預(yù)測(cè)早花相關(guān)蛋白的motif結(jié)構(gòu)域，預(yù)測(cè)基序數(shù)量為10個(gè)，其他參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值，分析其保守序列。 利用 ExPASy ProtScale（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）預(yù)測(cè)早花相關(guān)蛋白的疏水性。利用SOPMA網(wǎng)站（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和SWISSMODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.5 早花相關(guān)蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)的分析

利用 NetPhos（http：//www.cbs.dtu.dk/services/Net Phos/）在線分析早花相關(guān)蛋白中的磷酸化位點(diǎn)，包括絲氨酸（serine）、蘇氨酸（threonine）和酪氨酸（tyrosine）。

1.6 煙草早花相關(guān)基因的組織表達(dá)差異分析

利用煙草數(shù)據(jù)庫(kù)中的Expression中的Gene expression（http：//nadh.ice.mpg.de/NaDH/chart/expressi on_genes）網(wǎng)上分析工具，將9條煙草中早花相關(guān)基因的名稱輸入，進(jìn)行表達(dá)分析，并將得到的組織表達(dá)圖轉(zhuǎn)化成矩陣模式。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有試驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)測(cè)定2～4次，測(cè)得的結(jié)果取平均值。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及計(jì)算分析采用Excel 2010和PASW Statistics 18.0軟件進(jìn)行，制作圖表應(yīng)用Excel 2010軟件進(jìn)行，各水平處理之間進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 早花相關(guān)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

由表1可以看出，在26個(gè)早花相關(guān)的蛋白序列中，氨基酸數(shù)目變化范圍為105～1 664個(gè)，其中9條煙草早花相關(guān)蛋白的氨基酸數(shù)目最少，平均121個(gè)，而擬南芥和水稻的早花相關(guān)蛋白氨基酸數(shù)目較多。比對(duì)的26條蛋白序列中的氨基酸數(shù)量差異較大，其分子質(zhì)量變化范圍也較大，為12～191 kD；9條煙草早花相關(guān)蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)（pI）值，6條為酸性，3條為堿性。GRAVY預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)顯示煙草的早花相關(guān)蛋白為親水性蛋白。此外，利用在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站SignalP和TMHMM預(yù)測(cè)早花相關(guān)蛋白為親水性蛋白。SignalP和TMHMM預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，26條蛋白中除辣椒中有2條蛋白（CaELF31和CaELF41）有信號(hào)肽的可能性較大以外，其余的蛋白具有信號(hào)肽的可能性均較小。9條煙草早花相關(guān)的蛋白質(zhì)均無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，而水稻和擬南芥的早花相關(guān)蛋白具有跨膜結(jié)構(gòu)；煙草早花相關(guān)蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽序列，可能為非分泌性膜外蛋白。

表1 煙草早花相關(guān)基因及蛋白理化性質(zhì)和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

從煙草早花相關(guān)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果可以看出，煙草、番茄、辣椒、擬南芥和水稻早花相關(guān)蛋白主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成，但是在它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)中所占的比例差異較大，煙草中α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲的平均比例分別為61.82%和28.94%，番茄中早花相關(guān)蛋白α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲的平均比例分別為19.38%和65.93%，辣椒中早花相關(guān)蛋白α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲的平均比例分別為37.89%和52.12%，擬南芥和水稻中早花相關(guān)蛋白α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲的平均比例分別為43.62%和36.93%。

2.2 早花相關(guān)蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將煙草、擬南芥、番茄、辣椒及水稻共26個(gè)早花相關(guān)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列比對(duì)，利用MEGA構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）。結(jié)果表明，序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹主要分為2枝，一枝為番茄早花相關(guān)蛋白質(zhì)（4條）和辣椒早花相關(guān)蛋白質(zhì)（4條）；另一枝為煙草早花相關(guān)蛋白質(zhì)（9條）、辣椒早花相關(guān)蛋白質(zhì)（3條）、擬南芥早花相關(guān)蛋白質(zhì)（3條）、水稻早花相關(guān)蛋白質(zhì)（2條）和番茄早花相關(guān)蛋白質(zhì)（1條）。值得注意的是，煙草和辣椒中早花相關(guān)蛋白質(zhì)分類關(guān)系較近。

2.3 早花相關(guān)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、多序列比對(duì)與保守結(jié)構(gòu)域motifs分析

煙草和番茄早花相關(guān)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、多序列比對(duì)和蛋白序列保守基序預(yù)測(cè)分析的結(jié)果如圖2所示。可以看出，NtELF41由3條α-螺旋組成，其余8條早花相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)域由SH-box形成的β-轉(zhuǎn)角連接2個(gè)α-螺旋組成；9條煙草早花相關(guān)蛋白都含有2個(gè)保守基序（motif1和motif2），其中8條蛋白中含有 3個(gè)基序（motif1、motif2和 motif9），基序排列的位置基本一致，motif1的保守序列為VQSVLDR。5條番茄早花相關(guān)蛋白中，4條的基序類型（motif2、motif3、motif4、motif7 和 motif10）和排列位置（motif3-motif4-motif3-motif7-motif10-motif2）比較接近，其中蛋白SolyEFL51僅含有1個(gè)與其他均不同的基序。由此表明，9條煙草的早花相關(guān)蛋白可能同源；5條番茄的早花相關(guān)蛋白中4條可能是同源，而其中蛋白SolyEFL51可能與這些均不同源。

2.4 早花相關(guān)蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析

蛋白質(zhì)磷酸化是生物體內(nèi)一種普通的調(diào)節(jié)方式，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起重要作用。煙草中9條早花相關(guān)蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：9條蛋白都具有可能的磷酸化位點(diǎn)，但數(shù)量有差異，其中蛋白NtELF42、NtELF43、NtELF44 和 NtELF46 具有的磷酸化位點(diǎn)較多，可能在植物開花過(guò)程中起到了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，從而實(shí)現(xiàn)了DNA復(fù)制和花芽組織分化等調(diào)控功能。

2.5 煙草早花相關(guān)基因的組織表達(dá)差異分析

煙草早花相關(guān)基因在植株組織表達(dá)的結(jié)果顯示，基因NtEFL41和NtEFL42在根、莖、花冠、種子、花藥及花梗等組織中均有表達(dá)，其中NtEFL41在根、莖以及種子中高表達(dá)，NtEFL42和NtEFL44在花及花梗中較高表達(dá)，NtEFL43主要在葉中高表達(dá)；NtEFL45、NtEFL46、NtEFL47、NtEFL48 和 NtEFL49 在所有組織中均不表達(dá)。由此表明，不同的早花基因在不同的組織中表達(dá)差異明顯，具有組織特異性，暗示了這些基因參與了不同組織的生長(zhǎng)發(fā)育階段。

2021年由于前期的持續(xù)低溫，河南泌陽(yáng)大田出現(xiàn)了煙草早花。6月4日摘去大田早花煙株頂端花序，6月22日對(duì)打頂煙株和未打頂煙株的農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果表明，雖然二者之間的株高和莖周長(zhǎng)差異極顯著（P<0.01），最大葉長(zhǎng)之間差異顯著（P<0.05），但是煙葉的數(shù)量、最大葉寬、長(zhǎng)寬比及葉面積之間差異不顯著。煙葉成熟后期，早花打頂與未早花的煙株之間已經(jīng)差異不顯著。實(shí)踐結(jié)果表明，若煙草發(fā)生早花，應(yīng)盡快打頂處理，并促進(jìn)煙株在團(tuán)棵期后的生長(zhǎng)，可有效降低早花對(duì)煙草后期生長(zhǎng)發(fā)育的影響。

3 結(jié)論

9條煙草早花相關(guān)的ELF蛋白質(zhì)均無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽序列，為親水性非分泌蛋白，且屬于膜外蛋白。普通煙草ELF蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋的比例很高 （61.82%），除蛋白NtELF41由3條α-螺旋組成外，其余8條早花相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)域主要由SH-box形成的β-轉(zhuǎn)角連接2個(gè)α-螺旋組成。煙草ELF基因在進(jìn)化過(guò)程中保守性相對(duì)較強(qiáng)，結(jié)構(gòu)變化不大，與辣椒植物同源關(guān)系較近。蛋白NtELF42、NtELF43、NtELF44和NtELF46具有的磷酸化位點(diǎn)較多，推測(cè)在開花過(guò)程中可能具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。煙草ELF基因具有組織表達(dá)特異性，暗示了這些蛋白參與了不同組織的生長(zhǎng)發(fā)育階段。