桃金娘果多糖的制備及其免疫增強作用研究

盧光強，劉 偉，曾雪顏，趙 武，姜源明，銀慧慧

(1.廣西隆安縣動物疫病預防控制中心，南寧 532799；2.廣西壯族自治區獸醫研究所,廣西獸醫生物技術重點實驗室，南寧 530001)

植物多糖已被證實具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調節和抗糖尿病活性等生物活性，在生命科學和醫藥科學中都得到廣泛的應用[1-2]。目前，抗生素的不規范使用以及抗生素殘留和抗藥性問題日趨嚴重，一些抗生素能夠通過動物性食品轉移到人體中，對人類的健康造成了嚴重威脅。植物多糖與抗生素作用性質相同，并且具有高效、低毒、無殘留等優點。已有研究發現，在肉仔雞飼料中添加一定量的黃芪多糖，能夠改善三黃肉雞的生長性和其腸道微生物菌群系統[3-4]；在飼糧中添加復合益生菌和黃芪多糖能夠提高生長育肥豬的免疫功能[5]；茯苓多糖和白術多糖能顯著提高仔豬生長性能[6-7]；馬尾藻多糖可以促進豬和雞脾臟淋巴細胞增殖[8-9]。這些研究顯示，植物多糖作為一種綠色新型畜禽用飼料添加劑得到了廣泛關注。桃金娘Rhodomyrtustomentosa(Ait.) Hassk.為桃金娘科桃金娘屬常綠多花小灌木，是我國南方地區民間傳統習用中草藥，自然分布在熱帶及亞熱帶，我國主要生長在南部各省[10]。據《全國中草藥匯編》記載，桃金娘性味甘、澀、平，全株可供藥用，具有活血通絡、收斂止瀉、補虛止血功效。當前對桃金娘的化學成分及生物活性有了比較深入的研究[11-12]，但對桃金娘多糖的作用機制研究較少。本研究通過制備桃金娘果多糖，初步探究桃金娘果多糖在小鼠體內的免疫調節作用，為加大桃金娘的藥用開發力度，用于促進動物生長和提高動物免疫力提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 桃金娘果(產地：廣西玉林，經廣西獸醫研究所獸藥新技術開發中心鑒定為桃金娘果實，干燥后打粉，過四號篩)。小鼠白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素2(IL-2)、白細胞介素6(IL-6)、γ干擾素(IFN-γ)、過氧化物酶(POD)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；溶菌酶(LZM)試劑盒購自上海聯酶生物科技有限公司；生理鹽水購自江西御醫堂實業有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器 Nicolet iS5傅里葉變換紅外光譜儀(賽默飛世爾科技公司)；1260型液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；Cary 50紫外分光光度計(美國瓦里安公司)；分析天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；TECAN model Infinite M200酶標儀(瑞士帝肯公司)，恒溫水浴鍋(江蘇金怡儀器科技有限公司)；RE-2000A旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.3 動物和飼料 SPF級昆明小鼠80只，雌雄各半，體重(20±2)g，由長沙市天勤生物技術有限公司提供。實驗期間動物房溫度18～22 ℃，濕度50%～60%，小鼠自由攝食及飲水，適應性飼養4 d后進行實驗。SPF飼料由長沙市天勤生物技術有限公司提供。

1.4 方法

1.4.1 桃金娘果多糖的制備 采用水浴提取法，料液比1∶10，提取溫度80 ℃，提取時間90 min，過濾后旋轉蒸發儀濃縮，再按10∶1的比例加入5%的101果汁澄清劑，攪拌混勻室溫放置12 h后離心，上清液用95%乙醇醇沉，離心，沉淀揮干試劑，水復溶，用10 ku半透膜流動純化水透析12 h，95%乙醇醇沉，干燥得桃金娘果多糖。

1.4.2 桃金娘果多糖的含量測定 準確稱取桃金娘果多糖樣品3份， 溶解后采用苯酚-硫酸法[13]測定其吸光度，從回歸方程中求出桃金娘果多糖含量。多糖含量按照下式計算：

式中，m-多糖質量(mg)；c-多糖溶液中糖質量濃度(μg/mL)；V-供試液的體積(mL)；D-多糖稀釋倍數；a%-桃金娘果粉末水分含量；0.9-葡萄糖對多糖的校正系數。

1.4.3 單糖組分分析 參照文獻方法[14]，分別取1 mL多糖溶液(4 mg/mL)于水解瓶中，加入1 mL 4 mol/L的三氟乙酸溶液，在110 ℃下孵育3 h，冷卻至室溫后氮氣吹干，然后加入1 mL純水溶解得到水解樣品。在0.5 mL水解樣品中加入0.3 mol/L的NaOH溶液和0.5 mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液各0.5 mL，在70 ℃下避光孵育100 min，冷卻至室溫后加入0.5 mL 0.3 mol/L HCL溶液，混勻得到衍生化樣品。衍生化樣品用氯仿萃取除去PMP，水相離心后取上清液進行測定。單糖混合對照品溶液同上進行衍生化。

色譜條件：ZORBAX SB-C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相為乙腈-磷酸鹽緩沖液(pH 6.7)=17∶83(體積比)；檢測波長254 nm；流速為1.0 mL/min。

1.4.4 實驗動物分組及給藥 將80只昆明種小鼠隨機平均分成空白組、黃芪多糖組、桃金娘果多糖低、中、高劑量組共5組。黃芪多糖組每只小鼠按200 μg/(g·BW)劑量腹腔注射黃芪多糖混懸液，桃金娘果多糖低、中、高劑量組分別按50、100、200 μg/(g·BW)劑量腹腔注射桃金娘果多糖混懸液，空白組每只小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水0.02 mL/(g·BW)，1 次/d，連續給藥7 d。

1.4.5 小鼠臟器指數測定 于末次給藥后禁食不禁水12 h，對所有小鼠進行稱重。眼球采血，分離血清，置于-20 ℃冰箱保存待用；頸椎脫臼處死小鼠，取其胸腺、脾臟洗凈、吸干后稱量，按下式公式計算免疫器官指數。

1.4.6 小鼠血清細胞因子含量測定 于末次給藥后禁食不禁水12 h，對所有小鼠進行稱重。眼球采血，分離血清，根據試劑盒說明書檢測血清中白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-6(IL-6)、(γ干擾素)IFN-γ、溶菌酶(LZM)、過氧化物酶(POD)指標的含量。

1.4.7 數據處理 試驗數據均以± s表示, 用SPSS17.0軟件對結果進行統計分析和鄧肯氏多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 桃金娘果多糖含量測定及組分分析 按照1.4.2項測定不同濃度葡萄糖標準溶液的吸光度，得到吸光度值y對濃度c的回歸方程為：y=0.0722x+0.0132(R2=0.9992)，葡萄糖標準溶液在0～80.57 μg/mL 濃度范圍內呈良好的線性關系。按照1.4.1項提取得到的桃金娘果多糖含量為65.83±1.40%。

隨后對桃金娘果多糖進行組分分析，表明桃金娘果多糖至少由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖組成(圖1)，其物質的量比為0.08∶0.01∶0.08∶1.00∶0.08∶0.01∶0.06。

A-混合單糖對照品；B-多糖水解單糖樣品1、甘露糖；2、鼠李糖；3、半乳糖醛酸；4、葡萄糖；5、半乳糖；6、木榶；7、阿拉伯糖。A- Mixed monosaccharide reference substance; B-Polysaccharide hydrolysis monosaccharide sample1. mannose; 2. rhamnose; 3. galacturonic acid; 4. Glucose; 5. Galactose; 6. xylose; 7. arabinose圖1 桃金娘果多糖中各單糖液相色譜圖Fig 1 Liquid chromatography diagram of monosaccharidesin Rhodomyrtus tomentosa fruit polysaccharide

2.2 桃金娘果多糖對小鼠免疫器官指數的影響 桃金娘果多糖對健康小鼠脾臟、胸腺指數的影響見表1，桃金娘果多糖中、高劑量組的胸腺指數與空白組比較明顯下降，差異顯著(P<0.05)，桃金娘果多糖中、低劑量組和黃芪多糖組與空白組比較胸腺指數有所降低但無顯著差異(P>0.05)。與空白組比較，黃芪多糖組以及桃金娘低、中、高劑量組的脾臟指數顯著性增高(P<0.05)。

表1 桃金娘果多糖對健康小鼠免疫器官指數的影響Tab 1 Effect of Rhodomyrtus tomentosa polysaccharide on immune organ index of healthy mice

同列數據肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)(下同)。

2.3 桃金娘果多糖對小鼠血清細胞因子的影響 由表2看出，與空白組比較，桃金娘果多糖中、高劑量組顯著提高了IL-1β、IL-2、IL-6、IFN-γ血清細胞因子的水平(P<0.05)；桃金娘果多糖低劑量組的IL-2、IL-1β、IL-6、IFN-γ細胞因子與空白組比較無顯著差異(P>0.05)；黃芪多糖組則顯著提高了IL-6血清細胞因子含量，差異顯著P值<0.05。

表2 桃金娘果多糖對健康小鼠細胞因子水平的影響Tab 2 Effect of Rhodomyrtus tomentosa fruit polysaccharide on cytokine levels in healthy mice

2.4 桃金娘果多糖對小鼠溶菌酶和過氧化物酶的活性影響 桃金娘果多糖對小鼠溶菌酶和過氧化物酶的活性影響見表3。由表3可知，與空白組比較，黃芪多糖組和桃金娘果多糖低、中劑量組均可顯著增加小鼠的POD活性(P<0.05)，桃金娘果多糖低、中、高劑量組小鼠的LZM含量得到了顯著提高(P<0.05)，黃芪多糖組與空白組比較LZM含量顯示無統計學意義(P>0.05)。

表3 桃金娘果多糖對健康小鼠POD和LZM活性的影響Table 3 Effect of Rhodomyrtus tomentosa fruit polysaccharide on the activity and content in healthy mice

3 討論與小結

桃金娘是一種食藥同源的野生藥用植物資源，富含多糖、黃酮類、酚類等多種生物活性成分。本研究提取得到的桃金娘果多糖含量為65.83%，主要由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖組成。作為重要的免疫器官，胸腺和脾臟重量的變化能夠直接反映藥物對機體免疫應答的強弱。研究顯示[15-16]，多糖對小鼠的胸腺和脾臟具有一定的修復作用。本試驗的研究結果表明，桃金娘果多糖顯著提高小鼠的脾臟指數，但桃金娘果多糖高劑量顯著降低了小鼠的胸腺指數，提示桃金娘果多糖對小鼠的免疫器官有一定的影響，濃度越高，影響越大。促炎細胞因子IL-1β主要參與細胞增殖、分化和凋亡等多種細胞活動以及免疫性炎癥反應等。IL-2細胞因子又稱T 細胞生長因子，具有B細胞增殖、活化T細胞、NK細胞功能等生物功能作用。IFN-γ是機體免疫反應的主要調節劑，是激活免疫細胞的關鍵信號分子。IL-6具有B細胞分化生物功能，參與T細胞的早期激活。有研究顯示[17-18]，青蒿多糖和山藥多糖能夠調節機體的IL-2、IL-1β、IL-6、IFN-γ水平，促進細胞因子的分泌等。本試驗結果顯示，桃金娘果多糖中、高劑量組顯著提高了IL-1β、IL-2、IL-6、IFN-γ血清細胞因子的水平，提示桃金娘果多糖可通過調節細胞因子水平而對機體的免疫功能進行調節。

過氧化物酶POD能夠將氧化還原反應中產生的細胞毒性物質過氧化氫水解，并達到保護細胞的作用。溶菌酶LZM能夠發揮催化作用破壞某些細菌細胞壁，從而保護機體不受細菌的感染。有研究顯示[19-20]，黃芪多糖和山豆根多糖對POD和LZM具有調節作用。本研究結果顯示，桃金娘果多糖低、中劑量組均可顯著增加小鼠的POD活性，桃金娘果多糖低、中、高劑量組小鼠的LZM含量得到了顯著提高。

桃金娘果多糖具有改善小鼠免疫功能的作用。在本試驗條件下，桃金娘果多糖能夠顯著提高健康小鼠的脾臟指數、細胞因子IL-6、IL-1β、IFN-γ、IL-2、POD和LZM的含量，但濃度過高會引起小鼠胸腺萎縮。這一研究結果為桃金娘在飼料添加劑、動物保健及藥用資源的深度開發和應用等方面提供一定的參考依據。