歐盟關于食品動物用藥理活性物質殘留分析執行條例(EU)2021/808概述

孫 雷，王亦琳，葉 妮，尹 暉，張 驪，黃耀凌，王鶴佳

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

作為歐洲農業食物鏈治理的關鍵要素，歐盟官方控制規則被全世界公認為最佳實踐的典范。歐盟法規2002/657/EC[1]對藥物殘留分析方法的實施以及對活體動物和動物產品中藥物殘留分析結果的解釋提出了要求，98/179/EC[2]規定了監測活體動物和動物產品中藥物殘留的官方采樣詳細規則。這兩項決議都是在被廢除的理事會指令96/23/EC[3]的基礎上通過的，而且2002/657/EC不適用于在其他歐盟立法中制定了更具體規則的物質：食品中真菌毒素[4]、食品中二噁英和二噁英樣多氯聯苯(polychlorinated biphenyls，PCB)[5]以及食品中鉛、鎘、汞和苯并(a)芘[6]。鑒于新的科學發展以及法規的確定性和完整性，法規2002/657/EC和98/179/EC應廢除，并被新的法規取代。2021年3月22日，歐盟官方公報發布了歐盟委員會執行條例(EU)2021/808《食品動物用藥理活性物質殘留分析方法的性能、結果解釋和采樣方法》，該條例替代2002/657/EC和98/179/EC，自歐盟官方公報發布后第20日即從2021年5月21日起生效。該法規的發布實施，對我國從事動物性食品等產品中藥物殘留分析有很強的借鑒意義。

1 主要內容

(EU)2021/808包含正文及兩個附件，正文主要包括8個方面的內容：主題和范圍、術語定義、分析方法的要求、實驗室質量控制規定、結果解釋、采樣要求、廢除法規和過渡措施、生效等。附件1列出了常用分析方法的性能標準和要求；附件2規定了動物性食品的官方采樣程序和處理方法。

主題和范圍中規定該條例適用于活體食品動物、動物身體部位和體液、排泄物、組織、動物源產品、動物副產品、飼料和飲水中藥理活性物質殘留的采樣、實驗室分析方法以及分析結果的解釋。

術語定義中重點規定了49個術語定義：絕對回收率、準確度[7]、棄真誤差(α誤差)、被分析物、批準用物質[8]、去偽誤差(β誤差)、偏差、校正標準、有證標準物質(certified reference material，CRM)[9]、共色譜法(co-chromatography)、協作研究、確證方法、包含因子(k)、確證時的判斷限(CCα)、篩查時的檢測能力(CCβ)、添加樣品、實驗室間研究、內標(internal standard，IS)、關注濃度水平、最低校準濃度(lowest calibrated level，LCL)、基質、基質效應、基質匹配標準溶液、基質添加標準溶液、被測變量、測量不確定度、性能標準、精密度、定性方法、定量方法、回收率、回收率校正、標準物質[10]、相對基質效應、重復性、重現性[11]、耐用性、篩查方法、篩查目標濃度、選擇性、單一實驗室研究或內部驗證、標準加入法、標準被分析物、物質、試驗部分、正確度、單位、驗證[12]、實驗室間重現性或中等精度/內部重現性等。

實驗室質量控制、分析結果解釋以及采樣方法等內容，世界各國都有各自相應的法規文件規定，這里不再一一表述。本文重點介紹(EU)2021/808中動物性食品等產品中藥物殘留分析常用的篩查方法和確證方法的性能要求。

2 篩查方法的性能要求

篩查方法包括生物、生化或理化篩查方法，包括用作篩查的定性、半定量或定量方法。

對于禁用或未批準用藥物，篩查時的檢測能力(CCβ)應盡可能低，在任何情況下，CCβ都應低于(EU)2019/1871規定的已建立行動參考點藥物的行動參考點(reference point of action，RPA)。對于批準用藥物，CCβ應低于MRL(maximum residue limit)或ML(maximum level)。只有能夠以文件可追溯的方式證明經過了驗證且假陰性率(β誤差)小于或等于5%的分析方法才能用于篩查。如果出現可疑的陽性結果，則應通過確證方法進行確證。

用于篩查或確證的定量篩查方法應滿足下面3.2項的準確度和精密度要求。

3 確證方法的性能要求

3.1 確證方法的一般要求 對于禁用或未批準用藥物，CCα應盡可能低。(EU)2019/1871規定了RPA的禁用或未批準用藥物，CCα應小于或等于相應的RPA。對于批準用藥物，CCα應大于但盡可能接近MRL或ML。只有能夠以文件可追溯的方式證明經過了驗證且假陽性率(α誤差)對于禁用或未批準用藥物小于或等于1%，批準用藥物小于或等于5%的分析方法，才能用于確證。

確證方法應提供分析物的化學結構信息。因此，僅基于色譜分析而不使用質譜檢測的確證方法不適合用作禁用或未批準用藥物的確證方法。對于批準用藥物，在質譜法不適用時，可以使用其他方法，如HPLC-DAD法和HPLC-FLD法或它們的組合。

使用確證方法時，在提取步驟開始前，應添加適當的內標物。根據可用性，應使用特別適用于質譜檢測的穩定同位素標記形式的分析物，或與分析物在結構上密切相關的類似化合物。當沒有合適的內標物時，分析物的鑒別最好通過共色譜法進行確認。在這種情況下，只能獲得一個峰，增強的峰高(或面積)相當于添加的分析物的量。如果不可行，則應使用基質匹配或基質添加標準。

3.2 確證方法的通用性能要求 準確度(accuracy)是指檢測結果與公認的真實參考值之間的接近程度，通過正確度和精密度來確定。正確度(trueness)是指從一系列測試結果中獲得的平均值與公認的參考值之間的一致程度。精密度(precision)是指在規定條件下獲得的獨立測試結果之間的一致程度，以測試結果的標準差或變異系數(coefficient of variation，CV)表示。

3.2.1 正確度(trueness) 對于有證標準物質的重復分析，實驗確定的回收率校正平均質量分數與標準值的偏差應符合表1的最小正確度范圍。當沒有合適的CRM時，可以通過其他方式評估測量的正確度，例如使用具有實驗室間研究指定值的物質或使用已知量的分析物添加到空白基質中來進行評估。

表1 定量方法的最小正確度Tab 1 Minimum trueness of quantitative methods

3.2.2 精密度(precision) 在實驗室內重現性條件下，對標準或添加物質進行重復分析的變異系數(CV)不得超過Horwitz方程計算的水平。對于小于120 μg/kg的質量分數，應用 Horwitz 方程會產生不可接受的高值。因此，允許的最大變異系數不應大于表2中的值。在重復性條件下進行的分析其變異系數應小于或等于表2所列值的三分之二。

表2 可接受的變異系數Tab 2 Acceptable coefficient of variation

3.2.3 色譜分離要求 對于液相色譜法(liquid chromatography，LC)或氣相色譜法(gas chromatography，GC)，分析物的最小可接受保留時間應為色譜柱死體積保留時間的兩倍。分析物在提取物中的保留時間應與校準標準、基質匹配標準或基質添加標準的保留時間一致，偏差為±0.1 min。對于保留時間小于2 min的快速色譜，保留時間的偏差小于5%。如果使用內標，分析物的保留時間與內標物的保留時間之比(即分析物的相對保留時間)，應與校準標準、基質匹配標準或基質添加標準的相對保留時間一致，GC法的最大偏差為0.5%，LC法的最大偏差為1%。

3.3 質譜分析的特殊性能標準和其他要求

3.3.1 質譜檢測 質譜檢測應使用下列方式進行：(1)全掃描(full scan，FS)；(2)選擇離子監測(selected ion monitoring，SIM)；(3)串聯質譜(MSn)技術，如選擇反應監測(selected reaction monitoring，SRM)；(4)質譜(MS)或串聯質譜(MSn)技術與適當電離模式的組合。低分辨率質譜(low-resolution mass spectrometry，LRMS，單位質量分辨率)和高分辨率質譜(high-resolution mass spectrometry，HRMS)，包括如雙聚焦、飛行時間(time of flight，TOF)和軌道阱質譜都是合適的。

在使用高分辨率質譜(HRMS)確證分析物時，所有診斷離子的質量偏差應小于5 ppm(或在m/z<200時低于1 mDa)。同時，應選擇合適的有效分辨率，并且對于整個質量范圍在10%峰谷處的分辨率通常應大于10000或半峰全寬(FWHM)處大于20000。

質譜檢測時前體離子(precursor ion)應為準分子離子、分子離子的特征加合物、特征產物離子或其中一種同位素離子。非選擇性的碎片或產物離子(如失水離子)應盡可能不選。選用的特征離子的信噪比(S/N)≥3。待確證分析物的離子相對豐度應與在相同條件下濃度相當的基質匹配標準、基質添加標準或標準溶液的離子相對豐度一致，偏差在±40%以內。

3.3.2 鑒別(identification) 應使用鑒別點系統選擇適當的采集模式和評價標準。為了確證基質中已有MRL的藥物，至少需要4個鑒別點(identification points，IP)；對于禁用或未批準用藥物，需要5個鑒別點(IP)，其中一個鑒別點須來自色譜分離。

所有質譜法都應與一種色譜分離技術相結合，適合的分離技術包括液相色譜(LC)、氣相色譜(GC)、毛細管電泳(capillary electrophoresis，CE)和超臨界流體色譜(supercritical fluid chromatography，SFC)。如果分析物含有同分異構體化合物，保留時間的可接受性(即GC法為±0.5%，LC法和SFC法為±1%)是確證其存在的強制性要求。

表3所示為每種技術產生的鑒別點。為了獲得確證分析所需的鑒別點，通過不同技術獲得的鑒別點可以加和，最多可以組合三種單獨的技術來滿足最少鑒別點。不同的電離模式(例如電子電離和化學電離)被認為是不同的技術。表4給出了特定技術和技術組合得到鑒別點的示例。

表3 每種技術的鑒別點(IP)Tab 3 Identification points per technique

表4 特定技術和技術組合得到鑒別點的示例(n=整數)Tab 4 Examples of the number of identification points specific techniques and combinations of techniques (n=an integer)

3.4 質譜以外的檢測技術特殊性能要求 僅對于批準用藥物而言，下列技術可用作質譜法的替代方法，但須符合這些技術的相關要求：(1)全掃描二極管陣列檢測分光光度法(diode array detection spectrophotometry，DAD)與HPLC一起使用；(2)熒光檢測分光光度法(fluorescence detection spectrophotometry，FLD)與HPLC一起使用。具有UV/VIS檢測器(單波長)的液相色譜本身不適合用作確證方法。

3.4.1 全掃描二極管陣列分光光度法的性能標準 除了滿足色譜分離性能標準之外，分析物的紫外最大吸收應與基質中校準標準的波長在最大允許范圍內保持一致，最大允許范圍由檢測系統的分辨率決定。對于DAD，最大波長范圍通常在±2 nm以內。如果兩個光譜比較中存在相對吸光度大于或等于10%的時候，那么在220 nm以上的分析物的光譜應與校準標準的光譜不應有明顯差異。

當二者最大吸收波長相同，且兩個光譜之間的差異不大于校準標準吸光度的10%，則認定被分析物滿足標準。在使用計算機搜索和匹配譜庫時，樣品中的光譜數據與校準溶液的光譜數據比較必須超過臨界匹配因子，該臨界因子應在每個分析物的驗證過程中根據滿足上述標準的光譜來確定。驗證過程中，還應檢查由樣品基質和檢測器性能引起的光譜變化。

3.4.2 熒光檢測分光光度法性能標準 除了滿足色譜分離性能要求之外，結合色譜條件選擇激發和發射波長時，應盡量減少空白樣品提取液中干擾成分的影響。在激發波長和發射波長之間應該至少有50 nm的距離。色譜圖中最近的最強峰應與指定的分析物峰至少相距一個分析物最大峰高10%處的全峰寬。此規定適用于具有天然熒光和在轉化或衍生化后表現出熒光的分子的測定。

4 結束語

目前，國內獸藥殘留檢測方法標準的制修訂以及檢驗檢測任務的實施等工作中分析方法的性能要求都以歐盟法規2002/657/EC為基礎，其中色譜分離保留時間、離子鑒別點數要求、定性離子相對豐度等重要定性依據更是照搬歐盟這一法規。但歐盟法規2002/657/EC已于2021年廢除，新發布的歐盟法規2021/808對色譜分離保留時間、離子鑒別點數要求、定性離子相對豐度等進行了修改，變得更加科學，更易操作，因此，對國內相關工作的開展具有很強的借鑒意義。