酶催化橡膠籽油基富含亞麻酸的OPL型結(jié)構(gòu)酯

姚書一，滿佳妮，黃書鋮

（北京化工大學(xué)，北京 102200）

母乳中富含抗體，可以促進嬰兒免疫系統(tǒng)的發(fā)育，其中乳脂肪能夠為嬰幼兒提供大量易于消化吸收的營養(yǎng)成分以及能量，這是傳統(tǒng)的動物脂肪（如牛羊肉乳脂）和植物脂肪（如棕櫚油和胡麻油等）無法提供的。在胰脂肪酶的催化下，動植物脂肪酸與鈣離子結(jié)合生成不易消化的飽和脂肪酸鈣，使硬度上升，營養(yǎng)損失，益生菌的生長繁殖被抑制，造成便秘。但由于個人、社會等多方面的影響，導(dǎo)致我國的母乳喂養(yǎng)率較低，市場對嬰幼兒配方乳粉的需求量極大[1]。通過對母乳的分析發(fā)現(xiàn)，母乳脂肪的脂肪酸有大量脂肪以1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯（1,3-dioleoyl-2-palmitoylglycerol，OPO）的結(jié)構(gòu)存在。OPO型結(jié)構(gòu)酯在消化時不會產(chǎn)生難以消化吸收的飽和脂肪酸鈣，有利于嬰幼兒吸收營養(yǎng)。因此，OPO結(jié)構(gòu)酯是目前國內(nèi)外市面上常見的高端嬰幼兒奶粉的營養(yǎng)添加劑成分之一。但是，由于中國母體膳食結(jié)構(gòu)原因，母乳中亞油酸含量較高，且導(dǎo)致亞油酸/亞麻酸較高，高于推薦值。現(xiàn)有母乳脂肪替代品（OPO）的不飽和脂肪酸組成和中國母乳的不飽和脂肪酸組成存在一定差異，因此需要開發(fā)一種更適合中國嬰幼兒食用的奶粉營養(yǎng)強化劑。筆者認(rèn)為1-油酸-2-棕櫚酸-3-亞麻酸甘油三酯（1-oleoyl-2-palmitoyl-3-linoleoylglycerol，OPL）更適合作為中國嬰幼兒食用奶粉的營養(yǎng)強化劑，以代替OPO型結(jié)構(gòu)酯。對比了解多種動植物原料中的成分后，發(fā)現(xiàn)橡膠籽油較為適合作為OPL型結(jié)構(gòu)酯的合成原料[2]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

硫酸，98% AR；碳酸氫鈉，AR；氫氧化鉀，AR；乙醇，95% CP；Novozym?435，1 000 PLU/g， Novozymes；Novozym?40086，275 IUN/g，Novozymes；Lipozym TL IM，250 IUN/g，Novozymes；Candida sp.99-125，38 KLU/g；正己烷，AR；無水硫酸鈉，AR；氯化鈉，AR。

1.2 實驗方法

1.2.1 測定酶類型對酯轉(zhuǎn)換過程的影響

產(chǎn)酶菌株和固定化方法不同，脂肪酶活性、底物選擇和最佳反應(yīng)條件存在很大差異，因此選擇合適的脂肪酶在酯轉(zhuǎn)換化制備OPL過程中非常重要。選擇Novozym?435，Lipozyme TL IM，Novozym?40086 和Candida sp.99-125作為轉(zhuǎn)酯化酶，分別研究了不同類型的脂肪酶對轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的影響。以PPP∶橡膠籽油脂肪酸=1∶7為底物，添加PPP質(zhì)量10%的脂肪酶，在55 ℃，200 r/min的條件下，在搖床設(shè)備上催化反應(yīng)24 h。通過測量甘油三酯（Triacylglycerol，TAG）的含量來比較轉(zhuǎn)化速度的快慢。

1.2.2 溫度對脂肪酶活性有決定性的影響

一般情況下，當(dāng)溫度適當(dāng)升高時，酶催化反應(yīng)的活性會增加，但溫度過高會導(dǎo)致酶蛋白的不可逆變性和生物活性的喪失。因此，研究實驗過程中的最適溫度也是研究的熱點之一。以45 ℃、50 ℃、 55 ℃和60 ℃為溫度變量，在Novozym?40086的基礎(chǔ)上，振蕩反應(yīng)24 h，每4 h用氣相色譜法測定一次樣品中各組分的表征[4]。

1.2.3 脂肪酶添加量對水解反應(yīng)的影響

在反應(yīng)過程中，脂肪酶先通過活性位點與底物結(jié)合形成中間復(fù)合物。當(dāng)脂肪酶的用量達(dá)到一定濃度時，其對反應(yīng)的積極作用逐漸減弱[5]。同時，過多的脂肪酶會增加生產(chǎn)成本。因此，不同脂肪酶對轉(zhuǎn)酯化程度的影響也是生產(chǎn)過程中考量的重要因素之一。本實驗在前期實驗條件的基礎(chǔ)上，繼續(xù)研究同種催化脂肪酶Novozym?40086在不同的用量條件下（3%、5%、10%和15%）對轉(zhuǎn)酯生產(chǎn)OPL結(jié)構(gòu)酯的影響。

1.3 油脂酸價的測定

PPP樣品油的酸值按GB 5009.229—2016[3]進行測定。取少量油樣，準(zhǔn)確稱量，加入20 mL中性乙醇醚（1∶1）溶液，用超聲波機溶解樣品，加入2滴酚酞，得到待測溶液。用預(yù)先校準(zhǔn)的氫氧化鉀乙醇溶液滴定，濃度約為0.1 mol/L，當(dāng)溶液開始出現(xiàn)粉紅色停止滴定，按下式計算油的酸值：

式中：Av為樣品酸價，mg/g；56.11為KOH的摩爾質(zhì)量，單位mg/mmol；C為氫氧化鉀-乙醇溶液濃度，mol/L；V為氫氧化鉀-乙醇溶液消耗體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定酶類型對酯轉(zhuǎn)換過程的影響分析

由圖1知，各脂肪酶的初始產(chǎn)率均較高，但隨著反應(yīng)過程的進行，脂肪酶的催化效率逐漸降低，12 h后反應(yīng)體系中不同TAG的含量趨于平衡。Lipozyme?TL IM和Novozym?40086的催化反應(yīng)率和OPL產(chǎn)率（36.300%和37.540%）均 高 于Candida sp.99-125與Novozym?435脂肪酶（30.585%和34.545%）。然而，如表1所示，使用Lipozyme TL IM的體系中，總甘油酯（Glycerin Ester，GLE）的比例遠(yuǎn)低于使用Novozym?40086的體系中TAG的比例。這意味著使用Novozym?40086的體系中TAG的水解量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Lipozyme?TL IM，因此本實驗選用Novozym?40086作為催化脂肪酶。

表1 使用不同脂肪酶產(chǎn)物中甘油酯（GLE）的組成

圖1 不同脂肪酶的催化效果

2.2 溫度對水解反應(yīng)的影響

由圖2可知，反應(yīng)在初始階段，反應(yīng)速率隨著溫度的升高而快速上升。在55 ℃環(huán)境下，反應(yīng)平衡時（即反應(yīng)12 h后）產(chǎn)量為39.31%，而在60 ℃下，平衡時僅為35.62%，可推斷出脂肪酶在過高的溫度下發(fā)生了部分失活。雖然產(chǎn)量仍然比45 ℃、20 ℃高，但是綜合考慮生產(chǎn)成本條件和酶的可持續(xù)使用特點，得出在55 ℃時條件最適宜。

圖2 不同溫度下的催化效果

2.3 脂肪酶添加量對水解反應(yīng)的影響

由圖3可知，不考慮脂肪酶Novozym?40086用量比為3%時的反應(yīng)測定，不同脂肪酶添加量下的催化效果在12 h后達(dá)到平衡。

圖3 不同酶用量下的催化效果

在水平對比劑量下，反應(yīng)速率隨脂肪酶用量的增加而增加，平衡時反應(yīng)產(chǎn)率也呈正增加。但當(dāng)脂肪酶含量從PPP的10%增加到15%時，反應(yīng)速率沒有顯著增加，最終產(chǎn)物中OPL的產(chǎn)率為43.17%，與10%的產(chǎn)率（42.35%）相近。因此，綜合考慮OPL產(chǎn)量和生產(chǎn)成本，選擇10%的PPP酶劑量是最合適的。

3 結(jié)論

本文從橡膠籽中提取出OPL結(jié)構(gòu)酯運用到高端的乳粉中，研究了不同酶、不同溫度下、不同反應(yīng)途徑下，如何高效地提取出OPL結(jié)構(gòu)酯。實驗結(jié)果表明，富含亞麻酸、亞油酸的橡膠籽油脂肪酸作為原料可以高效產(chǎn)出OPL結(jié)構(gòu)酯，并有效防止Sn-2棕櫚酸的轉(zhuǎn)移。以橡膠籽油中的脂肪酸為基礎(chǔ)，研究了轉(zhuǎn)酯化制備OPL結(jié)構(gòu)酯的生產(chǎn)過程，PPP∶橡膠籽油=1∶7（摩爾比），加入10 wt%（以PPP質(zhì)量計）的Novozym?40086脂肪酶，脫水處理，在 55 ℃下，200 r/min反應(yīng)12 h，可以實現(xiàn)OPL產(chǎn)率為42.35%。 符合國家的標(biāo)準(zhǔn)，使生產(chǎn)技術(shù)日后用于大量生產(chǎn)OPL結(jié)構(gòu)酯成為可能。