響應面法優化提取牛骨蛋白酶解物及其對酵母增殖的影響

尹玉文，高鳴陽，張艷森，孫國杰*

河北科技大學食品與生物學院（石家莊 050000）

酵母菌是一種重要的微生物菌群[1]，在遺傳學分析、發酵等多方面具有卓越的優勢，在飼料和養殖業中的應用具有極大的潛力[2]。氮源是微生物生長不可或缺的營養物質，也是酵母菌生長所需要的關鍵營養元素[3]。氮源的種類繁多，每種氮源中含有的營養成分會有所差別[4]，每種微生物所需的氮源也不盡相同，因此為特定的菌種尋找最適的氮源、滿足細胞生長顯得尤為重要[5]。

牛骨的充分利用主要在于酶法提取營養物質的過程[6]。劉政等[7]研究表明，氨基酸形式的氮源對微生物的生長具有重要影響，不但對微生物的生長具有促進作用，同時能夠提高微生物發酵產率。黃菊等[8]通過復合蛋白酶處理牛骨后可生產高質量的蛋白胨，酶解工藝具有水解時間短、操作條件溫和、成本低、產品總氮與生物性好等優點，有利于高品質骨蛋白胨的研發與應用，可推廣到實際生產。劉定杭等[9]經酶法對牛骨蛋白胨進行不同程度的水解，得到11種蛋白胨，并且表明一些目的產品會受到蛋白胨中多肽分布及分子量大小的影響。

水解中使用的酶[10]是影響水解程度和氨基酸成分及產生肽段大小的關鍵因素。因此，控制酶解過程中的參數，以便能夠產生促進微生物生長的水解產物[11]。試驗以高壓處理的牛骨肉粉為底物，以氨基酸濃度為評價指標，從酶解溫度、時間、pH、復合酶添加量和料液比5個方面進行單因素試驗和響應面優化試驗，研究最佳酶解條件，探究牛骨肽作為氮源添加劑對酵母的影響，以期為酵母培養中氮的來源提供理論和數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛骨（石家莊農貿市場，牛骨儲存于-20℃）；胰蛋白酶（2 000 U/g）、胃蛋白酶（3 000 U/g）、木瓜蛋白酶（60 000～2 400 000 U/g）、中性蛋白酶（50 000～500 000 U/g）、復合蛋白酶：均購于東恒華道）；氫氧化鈉、鹽酸等（均為市售分析純）；胰蛋白胨和酵母粉（購于英國OXOID）；Tris-Tricine-SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、氨基酸（AA）含量檢測試劑盒等（購于索萊寶公司）；釀酒酵母（實驗室保存菌種）。

1.2 儀器與設備

KDN-1000自動凱氏定氮儀（上海斯嘉電子有限公司）；Ketagalan GL凝膠成像分析系統（美國威泰克有限公司）；DH3600BⅡ電熱恒溫培養箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；LS-B75L型蒸汽滅菌鍋（江陰濱江醫療設備有限公司）；玻璃儀器。

1.3 菌種與培養基

釀酒酵母由實驗室保存。YPD培養基：酵母粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL。酵母浸出粉骨肽葡萄糖培養基（yeast extract osteopeptide dextrose medium，YOD）含酵母粉10 g、骨肽20 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL。

1.4 試驗方法

1.4.1 牛骨酶解得到牛骨肽

取100 g新鮮牛骨，通過高溫滅菌鍋于0.1 Pa處理3 h分離油脂，于低溫50 ℃烘干后用粉碎機將骨塊粉碎，過0.850 mm（20目）篩，按照一定的料液比進行酶解，獲得的酶解液經過4 000 r/min離心20 min，得到的上清液于50 ℃烘干后獲得牛骨肽。

1.4.2 牛骨脫脂

將處理好的牛骨切成15 cm長條，放入高壓滅菌鍋中于0.1 Pa蒸煮1，2，3，4和5 h，除去油脂，計算脫脂率和蛋白損失率。脫脂后的牛骨放入55 ℃烘箱中烘12 h，烘干后切成5 cm左右的骨塊，粉碎，稱其質量。

1.4.3 牛骨肽化學成分測定

1.4.3.1 粗蛋白的測定

采用凱式定氮法[12]測定粗蛋白含量。

1.4.3.2 脂肪的測定

采用索氏提取法[13]測定脂肪含量。

1.4.3.3 灰分的測定

采用灼燒法[14]測定灰分含量。

1.4.3.4 水分的測定

采用105 ℃恒重法[15]測定水分含量。

1.4.3.5 游離氨基酸的測定

采用茚三酮法[16]，按照氨基酸（AA）含量檢測試劑盒檢測氨基酸含量。

1.4.3.6 氨基氮的測定[9]

采用電位滴定法測氨態氮，測定氨基氮含量。

1.4.3.7 骨肽分子量的測定

采用Tris-Tricine-SDS-PAGE凝膠制備試劑盒測定分子量。

1.4.4 單因素試驗

牛骨粉添加量1 g，酶解時間4 h，酶解溫度63 ℃，pH 9，料液比1∶2 g/mL，酶添加量為0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%，考察酶添加量對牛骨酶解的影響。

牛骨粉添加量1 g，酶解時間4 h，酶解溫度63 ℃，pH 9，酶添加量0.3%，料液比1∶1，1∶2，1∶3，1∶4和1∶5 g/mL，考察料液比對牛骨酶解的影響。

牛骨粉添加量1 g，酶解時間4 h，酶解溫度63 ℃，酶添加量0.3%，料液比1∶2 g/mL，pH為7，8，9，10和11，考察pH對牛骨酶解的影響。

牛骨粉添加量1 g，酶解時間4 h，酶添加量0.3%，pH 9，料液比1∶2 g/mL，酶解溫度為45，55，65，75和85 ℃，考察酶解溫度對牛骨酶解的影響。

牛骨粉添加量1 g，酶添加量0.3%，酶解溫度63℃，pH 9，料液比1∶2 g/mL，酶解時間為2，3，4，5和6 h，考察酶解時間對牛骨酶解的影響。

Supplementary information is available for this paper at https://doi.org/10.29026/oea.2018.170001

1.4.5 響應面試驗設計

根據單因素試驗結果，選擇合適的單因素范圍，利用Design-Expert 8.0.6軟件設計三因素三水平Box-Behnken響應面試驗，并對結果進行分析，因素及水平見表1。

表1 響應面因素與水平

1.4.6 驗證工藝

選取響應面得到的最優酶解工藝，平行3組，計算氨基酸的濃度，確定酶解的最優工藝。

2 結果與分析

2.1 牛骨成分分析

牛骨的主要成分見表2。可以看出，牛骨粗蛋白含量為13.98%，高于牛奶（3.5%）和雞蛋（13.3%）。粗蛋白的高含量證明，牛骨水解物具有作為食品營養特性添加劑的條件。

表2 鮮牛骨主要成分

2.2 牛骨脫脂

圖1為蒸煮時間與脫脂率及蛋白質損失率的關系。隨著蒸煮時間延長，脫脂率增大，但相應的蛋白損失也不斷增多。綜合考慮，高溫蒸煮軟化牛骨3 h，脫脂率和蛋白損失率均在可控范圍。牛骨打粉后過0.850 mm（20目）篩后稱其質量，得率約為52%。

圖1 蒸煮時間與脫脂率及蛋白質損失率的關系

2.3 蛋白酶的選擇

分別選用5種蛋白酶處理牛骨粉，結果如圖2所示。隨著酶解時間的延長，蛋白酶的酶解效果越來越好，骨膠蛋白酶水解6 h后，水解效果最好，水解所得的游離氨基酸達到51.97 μmol/g。骨膠蛋白酶酶解效果最好，原因可能是骨膠蛋白酶中含有多種酶系，可以同時對蛋白質肽鏈不同位點進行剪切，使其快速被分解成小肽及氨基酸，進一步研究骨膠蛋白酶的使用工藝條件。

圖2 多種蛋白酶酶解效果對比

2.4 復合蛋白酶使用工藝條件研究

2.4.1 單因素氨基酸含量的測定

通過對牛骨酶解過程中的酶解溫度、時間、料液比、pH、復合蛋白酶添加量5個條件進行單因素分析，由圖3（A）可得，牛骨蛋白肽的水解溫度升高，水解得到的氨基酸濃度先升高后下降，溫度達到55 ℃時，酶解得到的氨基酸濃度最高，為78.39 μmol/g；由圖3（B）可得，牛骨蛋白肽水解pH升高，水解得到的氨基酸濃度先升高后下降，pH 9時，酶解得到的氨基酸濃度最高，為75.25 μmol/g；由圖3（C）可得，牛骨蛋白肽的酶添加量升高，水解得到的氨基酸濃度先升高后保持穩定，酶添加量0.3%時，酶解得到的氨基酸濃度達到最高值88.17 μmol/g；由圖3（D）可得，牛骨蛋白肽的料液比中液體比例增大，水解得到的氨基酸濃度先升高后小幅下降，料液比1∶2 g/mL時，酶解得到的氨基酸濃度達到最高值70.13 μmol/g；由圖3（E）可得，牛骨蛋白肽酶解時間增大，水解得到的氨基酸濃度先升高后小幅下降，酶解時間6 h時，酶解得到的氨基酸濃度達到最高值70.01 μmol/g。從5個單因素中選取酶解溫度、酶解時間、酶添加量3個對酶解后氨基酸濃度影響最大的因素，進行響應面分析。

圖3 牛骨酶解過程的單因素分析

2.4.2 多因素試驗結果

2.4.2.1 響應面試驗設計

試驗結果數據見表3。經軟件Design Expert 8.0.5分析，氨基酸濃度與提取溫度（A）、提取pH（B）、酶的添加量（C）的二元多項式模型為Y=91.45-8.09A+2.18B+3.67C+2.97AB-2.75AC+1.53BC-21.32A2-9.94B2-6.89C2。

表3 牛骨肽提取工藝優化響應面試驗設計及結果

從表4中的方差分析可知，模型p＜0.000 1，說明以響應值（氨基酸濃度）建立的回歸模型極顯著。相關修正系數Radj2=0.926 3，表明模型的實測值與預測值吻合，失擬項p＞0.05，失擬項不顯著，表明二元多項式對試驗中的擬合較好。A2對試驗結果影響極顯著（p＜0.01）。由表4中F值大小可得到3個因素對氨基酸濃度的影響順序為溫度＞酶添加量＞pH。

表4 Box-Behnken試驗設計方差分析表

2.4.2.2 響應面圖分析及優化

根據模型繪制出各因素的等高線和響應面。如圖4（a）所示，酶解溫度和酶解pH繪制的影響面呈現坡度平緩，表明兩者之間存在交互作用不顯著；圖4（b）所示，酶添加量和酶解溫度所繪制的影響面呈現坡度平緩，表明兩者之間存在交互作用不顯著；圖4（c）所示，酶添加量和酶解pH等繪制的影響面呈現坡度平緩，表明兩者之間存在交互作用不顯著。這與回歸方程分析給出的結果一致。

圖4 各因素交互作用對牛骨肽提取中氨基酸濃度影響的響應面圖和等高線圖

2.4.2.3 驗證工藝

根據軟件Design-Expert 8.0.5預測的酶解最佳工藝為溫度62.97 ℃、pH 9.11、酶添加量0.33%。考慮到實際操作，溫度修正為63 ℃，平行3次試驗，得到酶解后氨基酸濃度為91.718 7 μmol/g，與理論值92.972 3 μmol/g接近。確定經響應面優化的酶解工藝可行。

2.5 骨蛋白胨酶解產品分子量分析

由圖5可知，牛骨肽的分子量在7.8～20.1 kDa之間，主要集中在14.4 kDa。

圖5 牛骨肽Tris-Tricine-SDS-PAGE電泳

2.6 產品理化指標及培養細菌生產試驗結果

2.7 不同蛋白胨培養酵母試驗結果

圖6顯示酵母菌在YPD和YOD這2種培養基中的生長狀態。隨著時間增長，酵母菌的增殖先達到遲滯期，接著來到快速繁殖的指數期，最后達到生長穩定期。由圖6可知牛骨制得的骨肽配成的YOD培養基中酵母在第8小時后逐漸進入指數生長期，工業生產的蛋白胨配成的YPD培養基中酵母在第12小時后逐漸進入指數生長期。綜上所述，從牛骨中獲得的牛骨肽具有替代微生物培養基中蛋白胨的潛力。

表5 蛋白胨理化指標檢測結果

圖6 酵母生長曲線

3 結論

試驗通過酶解法制備牛骨肽，在單因素試驗基礎上，通過響應面設計優化得到牛骨肽的最佳制備工藝：酶解時間4 h、酶解溫度63 ℃、pH 9.11、料液比1∶2 g/mL、酶添加量0.33%。在此條件下酶解液氨基酸濃度為91.718 7 μmol/g，分子量為7.8～20.1 kDa。

與市售蛋白胨相比，牛骨肽作為酵母氮源添加劑時，培養酵母的過程中能夠使酵母提前3 h進入對數生長期，提高酵母增殖速率。牛骨肽能夠促進酵母生長，加快酵母進入對數生長期，是一種高效營養助推器，為酵母發酵提供高效的營養源，加快發酵速度，縮短發酵周期，豐富酵母繁殖環境，提高酵母發酵能力。