酶法制備高含量多不飽和脂肪酸甘油三酯的工藝

馬良，張延秀*，范書(shū)琴，張建全，曲亭和，王坤

山東禹王制藥有限公司（禹城 251200）

魚(yú)油中富含ω-3多不飽和脂肪酸，尤其是二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），具有改善視力、抗疲勞、降血脂、有助于大腦發(fā)育、增強(qiáng)免疫力等多種生理功能。目前市場(chǎng)上銷(xiāo)售的魚(yú)油產(chǎn)品主要為乙酯型和甘油三酯型兩種，甘油三酯型是魚(yú)油中EPA和DHA的天然存在形式，與乙酯型魚(yú)油相比，甘油三酯型魚(yú)油具有生物利用度高[1-2]、吸收率高[3-4]、穩(wěn)定性高[5-7]等優(yōu)點(diǎn)。甘油三酯型魚(yú)油不但是EPA和DHA的天然存在形式，而且具有易于被人體吸收、食用安全、口感好、性質(zhì)穩(wěn)定、品質(zhì)高等優(yōu)點(diǎn)，隨著人們對(duì)健康的重視程度越來(lái)越高，全球精制魚(yú)油的需求量越來(lái)越大。

甘油酯型多不飽和脂肪酸產(chǎn)品作為藥品在經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)國(guó)家應(yīng)用日益廣泛，其制備方法主要有化學(xué)法、物理法和酶法[8-9]。國(guó)內(nèi)多采用傳統(tǒng)化學(xué)工藝生產(chǎn)甘油三酯型多不飽和脂肪酸，存在高能耗、溶劑殘留等缺點(diǎn)。近年來(lái)，酶法制備因其具有反應(yīng)效率高、專一性強(qiáng)[10]、反應(yīng)條件溫和、選擇性高、環(huán)境友好、能耗低等特點(diǎn)而引起人們的重視。脂肪酶是一類具有多種催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉(zhuǎn)酯化及酯類的逆向合成反應(yīng)。試驗(yàn)采用脂肪酶，催化乙酯型魚(yú)油轉(zhuǎn)化為甘油三酯型魚(yú)油。通過(guò)單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)優(yōu)化影響脂肪酶催化甘油三酯型魚(yú)油轉(zhuǎn)化率的酶添加量、底物摩爾比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等因素，得到優(yōu)化后的反應(yīng)條件，并形成一條可產(chǎn)業(yè)化的工藝路線。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脂肪酶（假絲酵母脂肪酶）；甘油（煙臺(tái)鴻和生物科技有限公司）；乙酯型魚(yú)油（山東禹王制藥有限公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

HCJ-4E恒溫水浴鍋（常州恩誼儀器制造有限公司）；D2004W磁力攪拌器（上海司樂(lè)儀器有限公司）；SHB-III真空泵（北京神泰偉業(yè)儀器設(shè)備有限公司）；1200高效液相色譜儀[安捷倫科技（中國(guó)）有限公司]。

1.3 檢測(cè)

1.3.1 樣品制備

用電子天平準(zhǔn)確稱取約50 mg樣品加入10 mL容量瓶中，用四氫呋喃溶解、稀釋并定容至刻度。

1.3.2 分析條件

色譜柱Phenogel，5 μm 100A，300 mm×7.8 mm，50 nm；流動(dòng)相為四氫呋喃，流速0.8 mL/min；甘油酯含量計(jì)算采用面積歸一法。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 底物摩爾比對(duì)乙酯轉(zhuǎn)化率的影響

選取底物摩爾比（乙酯型魚(yú)油和甘油）1∶1，2∶1，3∶1，4∶1和5∶1，酶添加量1%，溫度45℃，考察底物摩爾比對(duì)乙酯轉(zhuǎn)化率的影響。如圖1所示，隨著底物摩爾比增大，乙酯轉(zhuǎn)化率逐漸升高，但是當(dāng)?shù)孜锬柋瘸^(guò)3∶1時(shí)，乙酯轉(zhuǎn)化率變化趨勢(shì)變緩，考慮成本，選擇底物摩爾比3∶1，此時(shí)乙酯轉(zhuǎn)化率可達(dá)60%。

圖1 底物摩爾比對(duì)乙酯轉(zhuǎn)化率的影響

2.1.2 酶添加量對(duì)乙酯轉(zhuǎn)化率的影響

選取酶添加量1%，2%和3%，底物摩爾比3∶1，溫度45 ℃，考察酶添加量對(duì)乙酯轉(zhuǎn)化率的影響。

由圖2可以看出，酶添加量對(duì)達(dá)到反應(yīng)平衡的速度有重要影響，合適的酶添加量能使反應(yīng)體系快速達(dá)到平衡。隨著酶添加量增加，乙酯轉(zhuǎn)化率也逐漸增大；但酶添加量大于2%時(shí)，隨著酶添加量增加，乙酯轉(zhuǎn)化率變化不大。隨著反應(yīng)體系中酶加量增加，反應(yīng)底物與催化劑酶分子之間接觸機(jī)會(huì)增多，乙酯轉(zhuǎn)化率也隨之增大，但反應(yīng)體系中酶濃度很大時(shí)，添加酶對(duì)酯交換反應(yīng)并不產(chǎn)生顯著影響，而且添加酶會(huì)導(dǎo)致成本的增加，基于成本和經(jīng)濟(jì)條件考慮，酶添加量選擇2%。

圖2 酶添加量對(duì)乙酯轉(zhuǎn)化率的影響

2.1.3 反應(yīng)溫度對(duì)乙酯轉(zhuǎn)化率的影響

選取反應(yīng)溫度40，45，50和55 ℃，底物摩爾比3∶1，酶添加量2%，考察反應(yīng)溫度對(duì)乙酯轉(zhuǎn)化率的影響。

由圖3可以看出，反應(yīng)溫度小于50 ℃，乙酯轉(zhuǎn)化率隨溫度升高而增大，溫度大于50 ℃時(shí)，乙酯轉(zhuǎn)化率小幅下降，這是因?yàn)闇囟刃∮?0 ℃時(shí)，隨著溫度升高，底物溶解性增加使反應(yīng)程度增大，乙酯轉(zhuǎn)化率增加，但是較高的反應(yīng)溫度，可能會(huì)使脂肪酶失活，由于多不飽和脂肪酸屬于熱敏性物質(zhì)，在較高溫度下反應(yīng)一段時(shí)間，可能部分會(huì)發(fā)生氧化、降解等反應(yīng)，影響其反應(yīng)效果，導(dǎo)致乙酯轉(zhuǎn)化率降低。綜合考慮反應(yīng)速度、能耗及酶的操作穩(wěn)定性，選擇溫度50 ℃為宜。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)乙酯轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的影響

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)乙酯轉(zhuǎn)化率的影響

選取反應(yīng)時(shí)間5，10，15，20和25 h，溫度50℃，底物摩爾比3∶1，酶添加量2%，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)乙酯轉(zhuǎn)化率的影響。

由圖4可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，乙酯轉(zhuǎn)化率逐漸提高，但反應(yīng)時(shí)間超過(guò)15 h后，乙酯轉(zhuǎn)化率無(wú)明顯變化，因此反應(yīng)時(shí)間選擇15 h。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)乙酯轉(zhuǎn)化率的影響

2.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選定四因素三水平作酶法催化多不飽和脂肪酸乙酯制備多不飽和脂肪酸甘油三酯工藝優(yōu)化的正交試驗(yàn)，見(jiàn)表1。極差數(shù)據(jù)分析表明，影響乙酯轉(zhuǎn)化率的主次關(guān)系依次是底物摩爾比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、酶添加量。結(jié)果表明，最佳工藝參數(shù)為底物摩爾比3∶1、酶添加量3%、反應(yīng)溫度55 ℃、反應(yīng)時(shí)間15 h。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

試驗(yàn)用脂肪酶催化多不飽和脂肪酸乙酯制備多不飽和脂肪酸甘油三酯，分別探討底物摩爾比、酶添加量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)乙酯轉(zhuǎn)化率的影響，并在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)得出酶法制備多不飽和脂肪酸甘油三酯的最佳工藝參數(shù)：底物摩爾比3∶1，酶添加量3%，反應(yīng)溫度55 ℃，反應(yīng)時(shí)間15 h。試驗(yàn)結(jié)果為可產(chǎn)業(yè)化工藝路線的形成提供參考。