利用新會柑果漿培養海洋假絲酵母的發酵工藝

李義勇，陳柏忠，沈許源，葉偉，吳振強

1. 華南理工大學生物科學與工程學院（廣州 510006）；2. 廣東新寶堂生物科技有限公司（江門 529101）；3. 黑龍江大學生命科學院（哈爾濱 150080）；4. 廣東省科學院微生物研究所（廣州 510070）

海洋假絲酵母（Candida orthopsilosis）是近年來單分出的種屬[1]，無明顯致病性，無抗性也不耐藥[2]，具耐酸、耐高溫等環境適應能力[3]，并且表現出良好的拮抗作用[4]，對水果霉病有抑制作用，可用于生產可食保鮮膜[1]，具有廣闊的開發利用前景[5]。前提條件是實現海洋假絲酵母的規?；l酵培養，但卻鮮有該方面的報道。為了實現對海洋假絲酵母的工業化大規模生產，一方面需要采用廉價易得的培養基，另一方面需要降低發酵工藝要求。

新會陳皮是中國地理標志產品，為廣東省十大道地藥材之首，藥用價值以及經濟價值極高。陳皮取自新會柑的果皮，而果肉因味酸、口感不佳、產量巨大、又不耐存放等原因被當作廢料處理，丟棄量達20萬 t/年，對周邊的土壤和水體環境造成不良影響。為此，當地政府鼓勵企業采用多種途徑開發利用新會柑果肉，包括制作酵素、釀造果酒和生產有機肥，但仍只能消納小部分（約20%）。果肉丟棄現象仍然普遍存在。有研究表明，新會柑果肉營養豐富，其果漿可以直接作為培養基使用[6]。

前期從新會柑果肉中分離到1株內生真菌，經鑒定為海洋假絲酵母，且該菌株在新會柑果漿中生長良好。為研發基于新會柑果漿的海洋假絲酵母培養技術，試驗在開放式環境下，探討果漿稀釋與牛肉浸粉/葡萄糖/CaCO3添加等工藝條件對海洋假絲酵母生長的影響，獲得優化的工藝條件，為后續大規模的利用新會柑果漿培養海洋假絲酵母提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 海洋假絲酵母

1株分離自新會柑果肉的內生真菌，經鑒定為海洋假絲酵母C.orthopsilosis，保藏于廣東省微生物研究所藥用真菌課題組。

1.2 材料與試劑

新會柑果漿，將-30 ℃冷凍保存的新會柑果肉自然解凍后，經擠壓和紗布過濾，得到的液體即為果漿，其主要成分為：總糖6.78 g/100 mL，其中還原糖3.95 g/100 mL；總酸1.192 5 g/100 mL，pH 3.70；維生素C 0.021 4 g/100 mL。

牛肉浸粉（廣東環凱微生物科技有限公司）；CaCO3、葡萄糖（廣州東巨實驗儀器有限公司）。

1.3 儀器與設備

HZQ-X500C恒溫振蕩器（上海一恒科學儀器有限公司）；HT-CJ-2S無菌操作臺（安徽航天生物科技有限公司）；LDZX-75KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋（上海中安醫療器械廠）。

1.4 培養基

基礎培養基：新會柑果漿，現制現用。

營養肉湯瓊脂培養基、馬丁培養基、PDA培養基：均參照NY/T 2321—2013《微生物肥料產品檢驗規程》附錄B配制[7]。

1.5 試驗方法

1.5.1 基礎培養條件

取250 mL三角錐形瓶，裝入100 mL的培養基，在搖床中進行有氧發酵。接種量10%、培養溫度30 ℃、自然pH、搖床轉速120 r/min、培養周期24 h。

1.5.2 試驗設計

1.5.2.1 海洋假絲酵母直接開放式發酵

從活化后的海洋假絲酵母斜面上刮取1環菌苔，置于10 mL無菌生理鹽水中，制成菌懸液，將制得的菌懸液稀釋10倍后以1∶10的比例接種至裝有基礎培養基（未滅菌）的潔凈三角錐形瓶中，直接進行開放式發酵。24 h后，測定發酵液中的活菌數，并檢測雜菌數。

1.5.2.2 海洋假絲酵母培養條件優化

在直接開放式試驗的基礎上，改變果漿稀釋倍數（以無菌水為溶劑，稀釋0，2，4，6，8和10倍）、牛肉浸粉添加量（0，0.070，0.125，0.250，0.500和1.000 g）、葡萄糖添加量（0，0.250，0.500，1.000，2.000和4.000 g）及CaCO3添加量（0，0.025，0.050，0.075，0.100和0.125 g），探討這些條件對海洋假絲酵母生長的影響。每批次試驗后測定24 h時的發酵液活菌數，確定最佳生長條件。

1.5.3 活菌數的測定

采用平板菌落計數法，其菌落計數方法參照NY/T 2321—2013[7]進行。

1.5.4 雜菌數的測定

采用平板菌落計數法，其結果計算方法參照NY/T 2321—2013[7]進行。

2 結果與分析

2.1 海洋假絲酵母直接開放式發酵

前期研究表明，在基礎培養基平板上，該菌株的菌落為乳白色，質地均勻，正反面和邊緣、中央部位的顏色都很均一（見圖1），說明新會柑果漿可直接作為該菌株的培養基使用。

圖1 海洋假絲酵母菌落形態

經直接開放式發酵發現，該菌可適應新會柑果漿酸性環境，無需外加任何營養物質，在新會柑果漿中生長良好，發酵培養24 h后的活菌數可達6.5×107CFU/mL，無雜菌發生，發酵液pH 4.01，且氣味正常，無腐敗氣味。值得指出的是，一般認為，在開放式發酵體系中，未滅菌的發酵原料及空氣環境會帶入一定量雜菌，因此應該采取措施抑制雜菌生長[8]。試驗中未發現雜菌，可能的原因是新會柑果漿原料（果肉）本身相對潔凈，且該菌株為新會柑果肉內生真菌，本身更容易占據生態位優勢。

2.2 海洋假絲酵母培養條件優化

為進一步提高活菌數，探討果漿稀釋和牛肉浸粉/葡萄糖/CaCO3添加等條件對海洋假絲酵母生長的影響。

2.2.1 不同果漿稀釋倍數對海洋假絲酵母生長的影響

有研究表明，適度降酸有利于酵母菌生長[9]。由于新會柑果漿呈明顯酸性（pH 3.70），可能對海洋假絲酵母存在不良影響，因此，考察果漿稀釋度對該菌株生長的影響，結果見圖2。

圖2 不同果漿稀釋倍數對海洋假絲酵母生長的影響

由圖2可知，隨著稀釋度增加，活菌數呈現先增加后減少趨勢，說明直接使用新會柑果漿仍會對該菌株產生一定抑制作用，而適當稀釋可以緩解此抑制作用，有利于該菌株的生長。然而，過度稀釋可能造成營養成分不足，反而不利于該菌株的生長?？梢?，最佳條件為果漿稀釋4倍，此時活菌數達到7.8×108CFU/mL，最終pH為4.00。

2.2.2 不同牛肉浸粉添加量對海洋假絲酵母生長的影響

氮源對酵母菌生長有顯著影響，且有機氮源對酵母生長的促進作用要大于無機氮源[10-11]，故考察不同牛肉浸粉添加量對海洋假絲酵母生長的影響，結果見圖3。

由圖3可知，隨著牛肉浸粉添加，活菌數呈現先快速增加后緩慢減少的趨勢，說明適量補充牛肉浸粉十分有利于該菌株的生長。然而，過量添加的作用不大，因為所能提供的營養已經飽和。為節省發酵原料，建議最佳條件為0.125 g/L，此時活菌數達到1.7×108CFU/mL，最終pH為4.06。

圖3 不同牛肉浸粉添加量對海洋假絲酵母生長的影響

2.2.3 不同葡萄糖添加量對海洋假絲酵母生長的影響

有研究表明，適當提高糖度可以更好地滿足酵母菌生長[9]，故考察不同葡萄糖添加量對海洋假絲酵母生長的影響，結果見圖4。

圖4 不同葡萄糖添加量對海洋假絲酵母生長的影響

由圖4可知，隨著葡萄糖添加量增加，活菌數呈現先穩步增加后快速減少趨勢，說明適當補充葡萄糖的確有利于該菌株的生長。然而，一旦添加過量，其副作用立即凸顯。因此，建議最佳條件為1.000 g/L，此時活菌數達4.7×108CFU/mL，最終pH為4.67。

2.2.4 不同CaCO3添加量對海洋假絲酵母生長的影響

除了2.2.1的稀釋法降酸，還可通過添加CaCO3調節酸性，因此，考察不同CaCO3添加量對海洋假絲酵母生長的影響，結果見圖5。

由圖5可知，隨著CaCO3添加，活菌數呈現先緩慢后快速增加的趨勢，說明補充一定量的CaCO3的確有利于該菌株的生長。然而，添加量0.125 g/L時，開始出現CaCO3未被完全利用的情況。因此，建議最佳條件為0.125 g/L，此時活菌數達到5.0×109CFU/mL，最終pH為4.75。

圖5 不同CaCO3添加量對海洋假絲酵母生長的影響

綜上可見，牛肉浸粉添加、葡萄糖添加、果漿稀釋度和CaCO3的添加對海洋假絲酵母生長都產生明顯影響，且影響程度依次增強。其最優工藝條件為牛肉浸粉添加量0.125 g/L、葡萄糖添加量1.000 g/L、果漿稀釋4倍和CaCO3添加量0.125 g/L。

2.3 海洋假絲酵母最佳培養工藝

在優化工藝條件下，其活菌數可達9.5×109CFU/mL，且隨之發生絮凝現象（圖6），從而有利于后續回收利用[12]。

圖6 海洋假絲酵母的絮凝現象

通過試驗發酵工藝，一方面可以充分利用廉價易得的新會柑果漿培養基，另一方面可以降低對無菌發酵的嚴格工藝要求，能夠更好地滿足海洋假絲酵母的工業化大規模生產需求。既獲得了有價值的海洋假絲酵母，又實現新會柑果肉的資源化利用，具有經濟和環保雙重效益。

3 結論

新會柑果漿可直接作為海洋假絲酵母菌株的培養基使用。經直接開放式發酵培養24 h后，活菌數可達6.5×107CFU/mL，無雜菌發生。

牛肉浸粉添加量、葡萄糖添加量、果漿稀釋度和CaCO3添加量等對海洋假絲酵母生長都產生了明顯影響，且影響程度依次增強。其最優工藝條件為牛肉浸粉添加量0.125 g/L、葡萄糖添加量1.000 g/L、果漿稀釋4倍和CaCO3添加量0.125 g/L。

在最優工藝條件下，其活菌數可達9.5×109CFU/mL，且隨之發生絮凝現象，有利于后續回收利用。

采用新會柑果漿開放式培養海洋假絲酵母是可行的，不僅培養基廉價易得，而且發酵和回收便利，能夠滿足工業化大規模生產需求，既獲得有價值的海洋假絲酵母，又實現新會柑果肉的資源化利用。