花椒籽精油的提取及其抗氧化性研究

王莉，張霞

呂梁學院生命科學系（呂梁 033000）

花椒籽是將花椒的果皮分離所得到的種子，含有蛋白質、揮發性物質、脂肪、維生素E和較多的礦物質元素等[1]。花椒籽的香氣，來自于花椒籽籽皮的揮發性香精油成分，這是一種具有揮發性和高濃度芬芳氣味的油狀液體物質[2]，其相對分子質量很小，可通過蒸餾法提取。

20世紀70年代前后，國內外學者對花椒副產物及其提取物開展大量研究。Mohamed等[3]探索花椒籽的化學成分，結果發現大量的生物堿存在于花椒籽皮中。Wang等[4]研究花椒籽具有香氣的原因，結果發現花椒籽皮含有大量揮發性精油，使得花椒籽芳香濃烈。1998年，Jirovetz等[5]從未成熟的花椒籽表皮提取出香精油并得到40多種香味物質成分，以單萜為主兼有少量倍半萜烯[6]。劉雄[7]和胡小泓等[8]對花椒籽的萃取工藝進行研究，并分析了影響萃取條件的因素和適宜的條件，為花椒籽油的提取提供理論依據。為尋找使花椒籽出油率更高的方法，劉芳等[9]采用3種方法提取花椒籽油，經比較后發現，超臨界萃取法花椒籽油的提取率更高。袁海梅[10]在對花椒的化學成分研究中發現，抗氧化性是花椒籽提取物質的特性之一，并且隨著提取物含量增加，其抗氧化作用不斷增強。

此次試驗通過采用超聲波輔助蒸餾法提取花椒籽精油，并研究其提取物對羥自由基（·OH）和DPPH·的清除作用，為進一步開發花椒籽的深加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

花椒籽（產地山西省呂梁市汾陽）。

石油醚、過氧化氫、水楊酸、無水乙醇（以上藥品均來自天津市致遠化學試劑有限公司）；DPPH（PHYGENE）；抗壞血酸（國藥）。

高速多功能粉碎機（800Y，永康市鉑歐五金制品有限公司）；超聲波細胞破碎儀（Scientz-IID，寧波新芝生物有限公司）；集熱式磁力攪拌器（DZ-101S，金壇區西城基銘試驗儀器廠）；電子天平（JA203，上海豪晟科技儀器有限公司）；電熱鼓風干燥箱（101型，北京科偉永興儀器有限公司）；電加熱器（SD-109，南通長江光學儀器）；水蒸氣蒸餾裝置（鄭州卓越玻璃儀器廠）；分液漏斗（高德玻璃儀器耗材）；金屬篩（紹興市錦航儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 超聲波輔助蒸餾法提取花椒籽精油工藝流程

采用超聲波輔助蒸餾的方法提取花椒籽精油，提取的工藝流程：花椒籽→干燥（1 h）→粉碎（高速多功能粉碎機）→過篩（70目，即0.212 mm）→稱量（25 g）→超聲波處理（超聲波細胞破碎儀+集熱式磁力攪拌器、溫度60 ℃，功率200 W，時間60 min）→蒸餾→精油

1.2.2 單因素試驗

研究料液比、超聲波處理時間、超聲波處理溫度、超聲波功率對花椒精油提取率的影響，各單因素水平如表1所示。

表1 單因素試驗水平

1.2.3 花椒籽精油提取率計算

將花椒籽提取物過濾后進行蒸餾，收集精油，稱其質量，計算花椒籽精油提取率，按式（1）計算。

1.2.4 正交試驗

基于單因素試驗，分別在4個影響花椒籽精油提取率因素（料液比值、超聲波處理時間、超聲波處理溫度、超聲波功率）中各選3個最優水平進行四因素三水平L9(34)的正交試驗，得到花椒籽精油提取的最佳工藝組合。

1.2.5 花椒籽精油抗氧化性的研究

1.2.5.1 花椒籽精油對羥自由基（·OH）的清除作用

根據袁磊等[11]方法并加以改進。在刻度試管中依次加入2 mL濃度9 mmol/L FeSO4溶液、2 mL濃度9 mmol/L水楊酸溶液、2 mL不同濃度（2%，4%，6%，8%和10%）的花椒籽精油、2 mL濃度為8.8 mmol/L H2O2，混合均勻后，在37 ℃水浴保溫環境中反應30 min，510 nm波長下測定其吸光度。以相同濃度的維生素C為對照，由式（2）得出其對羥基自由基（·OH）的清除率。

式中：Ai為加入花椒籽精油溶液吸光度；Aj為花椒籽精油溶液在510 nm波長處的吸光度；A0為空白溶液的吸光度。

1.2.5.2 花椒籽精油對DPPH·的清除作用

根據Sun等[12]的方法并加以改進。用70%乙醇作溶劑配制25.6 mg/mL的DPPH·溶液，移取4 mL于517 nm處測定吸光度B0；準確稱量3.9 mL并加入0.1 mL不同濃度（2%，4%，6%，8%和10%）的花椒籽精油，混合均勻后，室溫避光反應30 min，波長517 nm處測定吸光度Bi，同時在3.9 mL無水乙醇溶液中加入0.1 mL不同濃度花椒籽精油，混合后測定其吸光度Bj。以相同濃度的維生素C為對照。清除率按式（3）計算。

式中：Bi為0.1 mL花椒籽精油+3.9 mL DPPH·的吸光度；Bj為0.1 mL花椒籽精油+3.9 mL無水乙醇溶液的吸光度；B0為4.0 mL ·DPPH無水乙醇溶液吸光度。

1.2.6 數據統計與分析

繪圖在Origin 2018 64Bit中完成，使用IBM SPSS Statistics 25軟件完成方差分析。采用正交設計助手II V3.1專業版軟件進行方差分析。數據以x±s表示，p＜0.05為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 不同料液比值對花椒籽精油提取率的影響

由圖1可知，隨著料液比值增加，花椒籽精提取率先升高后下降。料液比值在8～12 g/mL范圍內，花椒籽精油提取率隨料液比值的增加而逐漸升高，料液比值高于12 g/mL后其提取率呈下降趨勢，料液比值在12 g/mL時，花椒精油的提取率最高，為7.47%。可能是料液比值過高時，增溶于石油醚中的總精油量變化不大，但損失于石油醚中的精油量增加，最終導致提取率下降。

圖1 料液比對花椒籽精油提取率的影響

2.2 不同超聲波處理時間對花椒籽精油提取率的影響

如圖2所示，超聲波處理時間60 min時，花椒籽精油的提取率最高，為7.87%，超聲波處理時間超過60 min時，花椒籽精油提取率隨處理時間的延長而下降。超聲波處理時間短，花椒籽精油油胞的破裂率小，無法流出，導致花椒籽精油提取率不高。隨著超聲波處理時間延長，處理過程中細胞機械振動加強，導致細胞快速破裂，精油提取率隨之增高，但當超聲波處理時間超過60 min以后，花椒籽精油油胞又會隨溫度升高，一部分揮發到空氣中，導致提取率下降。試驗分析得出3個較優水平為45，60和75 min。

圖2 超聲波處理時間對花椒籽精油提取率的影響

2.3 不同超聲波處理溫度對花椒籽精油提取率的影響

由圖3可知，超聲波處理溫度低于60 ℃時，花椒籽精油的提取率隨處理溫度升高而增加，60 ℃時提取率達到最高，為8.27%，超聲波處理溫度超過60 ℃后，隨著溫度升高，精油提取率逐漸降低。可能是超聲波處理溫度越高，花椒籽精油油胞破裂越充分，提取率增高，但超聲波處理溫度超過60 ℃時，花椒籽中的一些成分被高溫破壞，導致花椒籽精油的提取率下降。

圖3 超聲波處理溫度對花椒籽精油提取率的影響

2.4 不同超聲波功率對花椒籽精油提取率的影響

由圖4可知，當超聲波功率低于200 W時，花椒籽精油提取率隨超聲波功率增加而增加。功率200 W時花椒籽精油提取率最大，為7.73%。超聲波功率超過200 W時，可能由于花椒籽精油隨超聲波功率的增加，導致其精油細胞被破壞，故提取率下降。

圖4 超聲波功率下花椒籽精油提取率的變化

2.5 正交試驗結果與分析

對花椒籽精油提取率的4個影響因素極差（R）作比較，超聲波處理溫度（C）＞料液比值（A）＞超聲波處理時間（B）＞超聲波功率（D），且3次均值（k）越大，提取率越高。如表2所示，花椒籽精油提取的最優方案為A1B3C3D1，即料液比值10 g/mL、超聲波處理時間75 min、處理溫度70 ℃、超聲波功率150 W時，該組合與正交試驗得到的提取率最高組合存在著差異，同時需要進行方差分析，研究4個因素對花椒籽精油提取率影響的顯著性。

表2 L9(34)正交試驗結果

由表3方差分析結果顯示，4個因素中只有處理溫度對花椒籽精油提取率的影響有顯著性（p＜0.05），料液比值、超聲波處理時間、超聲波功率對花椒籽精油提取率的影響均沒有顯著性（p＞0.05）。

表3 方差分析

2.6 花椒籽精油提取率的驗證試驗

根據正交試驗中極差（R）分析可知，花椒籽精油提取的最佳組合，并不是正交試驗得到的提取率最高組合A1B3C3D3，提取率為8.31%。所以要將方案A1B3C3D1與方案A1B3C3D3進行提取率進行驗證試驗，從而確定花椒籽精油提取的最佳組合，見表4。

表4 驗證試驗對比

通過對花椒籽精油提取率測定，可知由組合A1B3C3D1測出的提取率最佳，為8.37%。因此，最終確定最佳組合方案為A1B3C3D1，即料液比值10 g/mL、超聲波處理時間75 min、處理溫度70 ℃、超聲波功率150 W。

2.7 花椒籽精油抗氧化活性的研究

2.7.1 花椒籽精油對羥自由基（·OH）的清除作用由圖5可知，花椒籽精油對羥自由基（·OH）有一定清除作用，隨著花椒籽精油濃度增加，花椒籽精油對羥自由基（·OH）的清除作用增加，濃度10%時，花椒籽精油對羥自由基（·OH）清除率為79.68%，是相同濃度下維生素C的1.13倍。

圖5 不同濃度花椒籽精油對羥自由基（·OH）清除率的影響

2.7.2 花椒籽精油對DPPH·的清除作用

由圖6可知，花椒籽精油對DPPH·有一定清除作用，且花椒籽精油對DPPH·的清除作用隨著花椒籽精油濃度的增加而逐漸增加。濃度為10%時，花椒籽精油對DPPH·的清除率為81.08%，是相同濃度的維生素C的1.11倍。

圖6 不同濃度下花椒籽精油對DPPH·清除率的影響

3 結論

采用超聲波輔助蒸餾法提取花椒籽精油，采用料液比值10 g/mL、超聲波處理時間75 min、超聲波處理溫度70 ℃、超聲波功率150 W提取條件，花椒籽精油提取率能達8.37%。

通過花椒籽精油對羥自由基（·OH）和DPPH·的清除作用的研究，得到花椒籽精油有較強的抗氧化性，且花椒籽精油對羥自由基（·OH）和DPPH·的清除率強于相同濃度的維生素C。