蛋糕中脫氫乙酸提取的正交試驗優化及其含量的測定

楊旺火，孫麗香，陳月龍，王秋云，劉財行，陳嘉萍

廈門泓益檢測有限公司，肉食品安全生產技術國家重點實驗室（廈門 361000）

脫氫乙酸（dehydroacetic acid，DHA），又名脫氫醋酸，是一種新型的人工合成防腐劑，對霉菌和酵母有極強的抑制能力[1-2]。近年來，脫氫乙酸因為其出色的抗菌防腐能力而被廣泛地應用在蛋糕等食品中，以延長食品的保質期。脫氫乙酸在人體內的代謝研究尚不完善，但相關研究指出，其在人體內器官和血液中通過與氨基酸作用，從而抑制多種氧化酶[3]，對人體的腎臟、肝臟及中樞神經系統產生影響，并可能引發癌癥[4]。為此，美國、日本等國家都制定了嚴格的限量要求，而在一些歐洲國家甚至明確禁止在食品中使用脫氫乙酸。我國也將其列為SC食品認證相關品類的必檢項目，GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》規定脫氫乙酸在各類食品中的最大使用量限值，其中蛋糕中脫氫乙酸及其鈉鹽的最大限值為0.5 g/kg[5]。

已報道的食品中脫氫乙酸主要的檢測方法有氣相色譜法[6-7]、液相色譜法[8-12]、液相色譜-串聯質譜法[13]等，而在實際的檢測和政府監管工作中主要的檢測依據為GB 5009.121—2016《食品安全國家標準 食品中脫氫乙酸的測定》。大量的日常檢驗和企業產品研發檢測數據表明，采用GB 5009.121—2016中液相法對蛋糕基質食品中的脫氫乙酸進行測定，其結果與企業實際的添加量存在較大偏差，結果偏低，說明該標準對蛋糕基質的適用性較差。因此，有必要開發一種能夠準確測定蛋糕中脫氫乙酸含量的方法，不但能夠幫助企業客觀地評價產品的安全性能指標，還能夠指導企業合理使用添加劑，避免造成不必要的經濟損失；另外，一個適用性強、準確度高的檢測方法也能為監管部門進行食品安全監管提供有力支持。通過對蛋糕中脫氫乙酸提取條件進行單因素試驗，利用正交試驗法優化并確定脫氫乙酸測定的最優條件，確立一種能夠準確測定蛋糕中脫氫乙酸含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫氫乙酸標準品（純度99.9%，墨壇質檢）；甲醇（色譜純，德國Meker公司）；乙酸銨（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；氫氧化鈉、氨水、磷酸、硫酸鋅等（均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；試驗用水為GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規格和試驗方法》規定的一級水。

1.2 儀器與設備

Ultimate 3000高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；KQ-500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；LXJ-IIB離心機（上海安亭科學儀器廠）；Unique-R10超純水機（銳思捷科學儀器有限公司）；BSA224S-CW分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 脫氫乙酸的提取

蛋糕樣品用粉碎機粉碎或不銹鋼高速均質器均質后，準確稱取2 g樣品于50 mL刻度離心管中，加入約10 mL的水，加入不同體積質量濃度120 g/L的硫酸鋅沉淀劑，用20 g/L的氫氧化鈉溶液或9 mol/L的磷酸溶液，調節至不同的pH后，加水定容至25 mL，充分搖勻，于不同溫度下，超聲提取不同的時間后，以4 000 r/min離心5 min。取上清液過0.45 μm有機濾膜，供高效液相色譜測定。

1.3.2 單因素試驗

在GB 5009.121—2016《食品安全國家標準 食品中脫氫乙酸的測定》第二法的基礎上，分別對提取的時間、溫度、沉淀劑加入量和提取液pH進行研究，初步確定各因素對脫氫乙酸提取量的影響程度和較佳提取條件。

1.3.2.1 提取時間

分別稱取若干份樣品各2 g于50 mL刻度離心管中，加入約10 mL水，加入5 mL硫酸鋅沉淀劑，用氫氧化鈉溶液調節pH至7.5，加水定容至25 mL，充分搖勻，于室溫下，分別超聲提取5，10，15，20，25和30 min后，以4 000 r/min離心5 min。取上清液過0.45 μm有機濾膜，供高效液相色譜測定。每個水平進行2次平行試驗。

1.3.2.2 提取溫度

分別稱取若干份樣品各2 g于50 mL刻度離心管中，加入約10 mL水，加入5 mL硫酸鋅沉淀劑，用氫氧化鈉溶液調節至pH 7.5，加水定容至25 mL，充分搖勻，在20，30，40，50，60，70和80 ℃下，超聲提取10 min后，以4 000 r/min離心5 min。取上清液過0.455 μm有機濾膜，供高效液相色譜測定。每個水平進行2次平行試驗。

1.3.2.3 沉淀劑加入量

分別稱取若干份樣品各2 g于50 mL刻度離心管中，加入約10 mL水，分別加入3，4，5，6和7 mL硫酸鋅沉淀劑，用氫氧化鈉溶液調節至pH 7.5，加水定容至25 mL，充分搖勻，于室溫下超聲提取10 min后，以4 000 r/min離心5 min。取上清液過0.455 μm有機濾膜，供高效液相色譜測定。每個水平進行2次平行試驗。

1.3.2.4 提取液pH

分別稱取若干份樣品各2 g于50 mL刻度離心管中，加入約10 mL水，加入5 mL硫酸鋅沉淀劑，用氫氧化鈉溶液或磷酸溶液調節pH分別為7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5和10.0，加水定容至25 mL，充分搖勻，于室溫超聲提取10 min后，以4 000 r/min離心5 min。取上清液過0.45 μm有機濾膜，供高效液相色譜測定。每個水平進行2次平行試驗。

1.3.3 正交試驗設計

在前期單因素試驗的基礎上，選取提取時間、沉淀劑加入量、提取液pH和提取溫度4個因素的3個較佳水平進行L9(34)正交試驗，重復3次，因素水平見表1。

表1 L9(34)正交試驗因素水平表

1.3.4 脫氫乙酸的HPLC分析

利用高效液相色譜法測定蛋糕中脫氫乙酸含量。精確稱取25 mg脫氫乙酸標準品，用20 g/L的氫氧化鈉溶解后，用水定容至25 mL，得到質量濃度1.0 mg/mL的脫氫乙酸儲備液，用水稀釋制得質量濃度1，2，5，10，20和50 μg/mL的標準工作液，與處理后的樣液一起進高效液相色譜儀進行分析測試。

液相色譜條件為：色譜柱，月旭XB C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相A 20 mmol/L乙酸銨（每升添加20 μL甲酸），B甲醇（A∶B=90∶10，V/V），等度洗脫；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長293 nm，光譜采集范圍190～400 nm；進樣量10 μL。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取時間

如圖1所示，在5～15 min的時間段內，隨著超聲時間的延長，脫氫乙酸提取量的增加幅度較大，從超聲5 min的0.173 g/kg增加到15 min的0.258 g/kg，而15 min后則呈現小幅增加，并趨于穩定，這可能是由于在蛋糕基質超聲過程中，在前15 min大量游離的脫氫乙酸被水溶液大量提取釋放出來，在15 min后由于超聲放熱，導致蛋糕的基質溶脹，包裹在基質里的少量脫氫乙酸被緩慢釋放出來，呈現小幅度增加。因此15 min為脫氫乙酸提取的最佳超聲時間。

圖1 超聲時間對脫氫乙酸提取量的影響

2.1.2 沉淀劑加入量

如圖2所示為沉淀劑加入量對脫氫乙酸提取效果的影響。沉淀劑加入量對結果的影響較小，沉淀劑加入量小于6 mL時，脫氫乙酸提取量處于相對穩定的水平，沉淀劑加入量為7 mL時，脫氫乙酸提取量出現略微下降的情況，這可能由于沉淀劑的過量加入，導致基質被沉淀劑覆蓋，無法完全提取；沉淀劑加入量為3 mL時，樣品在最后過膜時由于蛋白沉淀不徹底，導致阻力較大，容易造成濾膜穿透，樣液渾濁，考慮到經濟環保的要求，又確保充分沉淀樣品中的蛋白，沉淀劑添加量5 mL較為合適。

圖2 沉淀劑加入量對脫氫乙酸提取量的影響

2.1.3 提取水浴溫度的影響

從圖3可以看出，隨著超聲波溫度增加，脫氫乙酸提取量不斷增大，溫度達到60 ℃后，提取結果趨于穩定，說明隨著溫度提高，蛋糕基質能更好地溶于提取液，有利于基質中脫氫乙酸的提取，但溫度又不宜過高，否則影響試驗的可操作性，因此提取溫度在50～70 ℃為宜。

圖3 水浴溫度對脫氫乙酸提取量的影響

2.1.4 提取液pH的影響

從圖4中可以看出，隨著提取液pH增加，脫氫乙酸提取量不斷變大，特別是pH達到8.5時，脫氫乙酸提取值先出現一個跳躍，后趨于穩定，而pH 9.5時出現提取液過膜困難的情況，達到pH 10.0時，沉淀劑硫酸鋅與堿發生反應而失效，提取液呈果凍狀，無法過膜。脫氫乙酸化合物呈酸性，在堿性環境中呈離子狀態，在水中的溶解度增大，更容易被提取出來，隨著pH增加，脫氫乙酸的提取量逐漸變大，但pH的增大容易損壞色譜柱，因此較佳的pH范圍為8.0～9.0。此外，在堿性的提取環境下，蛋糕基質乳化劑中的油脂可能被皂化水解，減少樣品在提取過程中的乳化作用，有利于脫氫乙酸從基質中釋放出來，增加提取量。

圖4 提取液pH對脫氫乙酸提取量的影響

2.2 正交試驗結果

基于單因素試驗分析，進行四因素三水平的正交分析試驗，試驗方案根據表1的因素與水平設計，采用極差分析法對數據進行分析，結果見表2。由表2結果可以看出，各個因素對脫氫乙酸的提取效果影響的主次順序為C＞D＞B＞A，即提取液pH＞提取溫度＞沉淀劑加入量＞提取時間，每個因素中當K值最大為最佳試驗組合，即A2B1C2D3，提取時間20 min、沉淀劑加入量4 mL、提取液pH 8.5、提取溫度70 ℃時，脫氫乙酸的提取效果最好。

表2 正交試驗設計L9(34)提取優化結果

3 實際樣品的測定

采用正交試驗優化后的最佳組合因素對3家不同生產廠家的3份蛋糕樣品中的脫氫乙酸含量進行測定，相同的樣品同時按GB 5009.121—2016第二法進行測定，將2種方法測定的結果與廠家的理論添加值進行比較，具體結果見表3。

表3 試驗方法、國標方法與理論添加量的比較 單位：g/kg

采用優化后的方法進行測定的脫氫乙酸數值與3家廠商配方的理論添加量較為接近，而國標方法測定的3組數值均只有理論添加量的40%左右，說明國標方法在測定蛋糕中脫氫乙酸含量時結果存在較理論添加值普遍偏低的情況，需進行適當的改進。

4 結論

通過分析提取時間，提取溫度、提取液pH和沉淀劑加入量4個因素對蛋糕中脫氫乙酸提取的影響，并通過正交優化試驗得到最優組合，結果表明當提取時間20 min、沉淀劑加入量4 mL、提取液pH 8.5、提取溫度70 ℃時，脫氫乙酸的提取效果最好。采用最佳的試驗條件對不同廠家的蛋糕中脫氫乙酸含量進行測定，結果與理論添加劑值相符，說明該方法準確度高，適用于蛋糕中脫氫乙酸含量的測定。