猴頭菇成分及提取物抗氧化性和抗癌性研究

張麗娜，金鐵巖*，楊辛雅，郭玉媛，張智勇

延邊大學農學院（延吉 133002）

在正常狀態下，機體的氧化和抗氧化之間處于平衡狀態，氧化應激是病理狀態，當機體出現氧化應激時，氧化和抗氧化的平衡狀態被打破，可能會導致過量的自由基積累，過量自由基會對機體內的DNA等生物大分子造成損傷作用，最終對機體造成損害，并引發一系列的并發癥[1-2]。同時，癌癥是世界上第二大死亡原因，對人類的健康和生命有著嚴重威脅[3]。近年來，越來越多研究關注天然植物食品在抗癌活性方面的作用[4]，逐漸成為研究熱點。研究并開發具有天然良好抗氧化、抗癌活性的天然物質對醫藥及保健領域而言十分重要。

猴頭菇（Hericium erinaceus）屬于擔子菌門、層菌綱、非褶菌目、猴頭菇屬[5]，是腐生菌的一種。野生猴頭菇大部分生長在東北的大興安嶺和西北的天山等地區。猴頭菇作為高等真菌，自古以來受到人們的重視和喜愛，其含有多種營養成分、多種維生素和微量元素[6]，并且猴頭菇有很好的藥效作用，可用于治療消化不良、胃潰瘍、胃炎等消化系統疾病。近些年國外的研究發現，猴頭菇中含有豐富的多酚以及黃酮類物質[7-8]，具有清除自由基[9]、消炎[10]、抗菌[11-13]、殺死癌細胞[14]等活性。近年來，在猴頭菇功能性成分的研究中，猴頭菇多糖對胃的保護作用[15]最受到關注，關于其提取物抗氧化性和抗癌性方面的相關研究相對較少，因此，試驗對猴頭菇的一般成分和功能性成分進行測定，用乙醇和熱水提取猴頭菇，并對猴頭菇提取物的抗氧化活性和抗癌活性進行測定。試驗結果將為猴頭菇的綜合開發應用提供理論數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

猴頭菇：采摘自黑龍江省海林市。

人肝癌細胞（HepG2）、人結腸癌細胞（HT29）：購于中科院上海細胞庫。

95%乙醇（分析純，天津市凱通化學試劑有限公司）；蘆丁（色譜純，上海恒遠生物科技有限公司）；沒食子酸（色譜純，上海源葉生物科技有限公司）；DPPH標準品（色譜純，上海華藍化學科技有限公司）；抗壞血酸（VC，分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；ABTS溶液（分析純，上海源葉生物科技有限公司）；過氧化氫（分析純，廈門安永博科技有限公司）；RPM1-1640培養基（上海源葉生物科技有限公司）；DMED培養基（武漢普諾賽生命科技有限公司）；MTT試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）；Hoechst33258熒光染色劑（北京百奧萊博生物科技有限公司）；細胞凋亡試劑盒（武漢普諾賽生命科技有限公司）；胎牛血清、胰蛋白酶，碘化丙啶（PI）、5-氟胞嘧啶、苦參堿（上海源葉生物科技有限公司）。

1.1.2 主要儀器與設備

U-3900紫外可見分光光度計（日立天美司）；QFST-250SQ索式提取儀（浙江普托儀器有限公司）；KDN-08A凱式定氮儀（上海明嘉電子有限公司）；MA45紅外水分測定儀（深圳市分析儀器制造有限公司）；BS223S電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；GHP-9080N恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；SHA-C水浴恒溫振蕩器（常州市華普達儀器有限公司）；Sergy酶標儀（深圳市愛康科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 猴頭菇一般成分的測定

參照GB 5009.3—2016[16]的直接干燥法測定水分含量，參照GB 5009.4—2016[17]第一法來測定粗灰分含量，參照GB 5009.5—2016[18]凱氏定氮法測定粗蛋白質含量，參照GB 5009.6—2016[19]索氏抽提法測定粗脂肪含量，碳水化合物含量為100%中減去水分含量、粗灰分含量、粗蛋白含量和粗脂肪含量。

1.2.2 猴頭菇提取物制備

將干燥的猴頭菇粉碎后分別用80%乙醇和熱水提取。料液比為1∶10 g/mL。使用90 ℃熱水提取120 min。在25 ℃下使用乙醇提取38 h。試驗步驟重復3次并把濾液進行合并，后置于旋轉蒸發儀中直至原體積1/10，后使用冷凍干燥機凍干，分別得到猴頭菇乙醇提取物和猴頭菇熱水提取物。放入-20 ℃的冰箱中備用。

1.2.3 總酚含量的測定

總酚含量（TPC）測定參照文獻[20]。

1.2.4 總黃酮含量的測定

總黃酮含量（TFC）測定參照文獻[21]。

1.2.5 DPPH·清除活性的測定

采用文獻[22-23]的方法進行測定，DPPH清除率按式（1）計算。

式中：R為DPPH清除率，%；A1為試驗組的吸光度；A2為樣品組的吸光度；A3為空白組的吸光度。

1.2.6 ABTS+·清除活性的測定

采用文獻[22-23]的方法進行測定。ABTS清除率按式（2）計算。

式中：R為ABTS+清除率，%；A0為試驗組的吸光度；A1為樣品組的吸光度。

1.2.7 ·OH-清除活性的測定

采用文獻[22-23]的方法進行測定。將1.0 mL 1.865 mmol/L鄰二氮菲的無水乙醇溶液以及1.0 mL 1.865 mmol/L的FeSO4·7 H2O溶液、2 mL 0.2 mmol/L磷酸鹽緩沖液以及1 mL的0.03%過氧化氫先后加入具塞試管中并充分混合均勻，置于密封狀態下進行恒溫水浴反應，溫度為37 ℃，時間為1 h，隨后用紫色分光光度計測其536 nm處的吸光度，OH-自由基清除率按式（3）計算。

式中：R為OH-清除率，%；A0為空白組的吸光度；A1為試驗組的吸光度；A2為損傷組的吸光度。

1.2.8 猴頭菇提取物的抗癌活性測定

首先對細胞進行培養，將HepG2、HT29細胞接種于含有10% FBS的低糖DMEM培養基上，后放置于恒溫培養箱中進行培養，培養時間為48 h，溫度為37 ℃，CO2含量為5%。試驗使用MTT法測定猴頭菇提取物的抗癌活性，使用0.25%胰酶消化培養好的癌細胞，使其成為1×104cells/mL的細胞懸液，接種在96孔板中并加入不同濃度的猴頭菇提取液，使其充分反應，72 h后，加入MTT溶液并放入恒溫培養箱，培養4 h后將DMSO加入其中，隨后為使晶體充分溶解，使用搖床低速振蕩，時間為10 min。在490 nm波長處測定各孔吸光度。HepG2 細胞試驗、HT29細胞試驗分別使用5-氟胞嘧啶（5-FU），用苦參堿（Mat）作為陽性對照。

2 結果與分析

2.1 猴頭菇粉末中的一般成分含量

由表1可知，其中水分含量8.40%±0.01%，粗灰分含量7.37%±0.01%，粗脂肪含量3.15%±0.02%，粗蛋白含量24.52%±0.01%，碳水化合物含量56.56%±0.02%。將猴頭菇的粗灰分、粗脂肪、粗蛋白含量與于士軍等[24]對四種食用菌（金針菇、猴頭菇、香菇）的營養成分分析進行對比發現，與其他三種食用菌相比，猴頭菇中粗脂肪、粗蛋白、粗灰分含量均相對較高。

表1 猴頭菇一般成分含量 單位：%

2.2 總酚及總黃酮含量測定

有研究[25-26]指出，酚類化合物是所有自然產物中的主要抗氧化活性成分，它廣泛存在于綠色植物中，并可能是植物提取物中的主要抗氧化劑。而根據表2所顯示，沒食子酸標準曲線方程為y=0.089 3x+0.011 1（R2=0.999 8），蘆丁標準曲線方程為y=0.082 6x+0.006 7（R2=0.999 8）。根據方程計算得猴頭菇粉末中的總酚和總黃酮含量分別為3.43×105μg/kg和3.0×105μg/kg。

表2 猴頭菇中總酚和總黃酮含量

2.3 DPPH·清除活性

DPPH·是一個穩定的以氮為中心的自由基，DPPH·已經被廣泛地使用作為反應樣品抗氧化的能力的方式[27]。猴頭菇不同提取物對DPPH清除率結果如圖1所示。隨著提取物濃度的增加，其對DPPH自由基的清除率隨之升高，濃度和清除率之間有著量效關系。在測定濃度范圍內，除提取物質量濃度為0.5 mg/mL外，熱水、乙醇、VC三者對DPPH自由基的清除率存在顯著差異（p＜0.05）。當提取物質量濃度為0.5 mg/mL時，乙醇提取物和熱水提取物的清除能力相近，清除率分為63.4%和58.1%，兩者之間無顯著差異（p＞0.05）。在此之后隨著樣液濃度的增加，乙醇提取物始終保持比熱水提取物更優的清除效果，且兩者的清除能力產生明顯差距，最終兩者清除率分別達到94.1%和85.1%，均處于較高水平。

圖1 猴頭菇提取物DPPH自由基清除率

2.4 ABTS+·清除活性

如圖2所示，隨著樣品濃度的逐漸升高，猴頭菇乙醇提取物、熱水提取物對ABTS自由基的清除能力均隨樣品濃度的升高而增大，且都表現出了明顯的對ABTS的清除能力。在測定濃度范圍內，猴頭菇乙醇提取物清除率始終高于熱水提取物。在較低質量濃度（0.10～0.05 mg/mL）時，乙醇提取物和熱水提取物對ABTS的清除能力差異并不顯著（p＞0.05），在較高質量濃度（1.00～3.00 mg/mL）時，乙醇提取物、熱水提取物與陽性對照之間存在顯著差異（p＜0.05），在質量濃度為3.00 mg/mL時，兩者清除率分別達到73.5%和67.8%。在相同質量濃度下，抗壞血酸對ABTS自由基的清除能力始終為最高水平，熱水提取物始終為最低水平。

圖2 猴頭菇提取物ABTS自由基清除率

2.5 ·OH-清除

如圖3所示，猴頭菇提取物均對OH-有一定的清除能力，且隨著樣液濃度的增加而升高，即與樣液濃度之間有一定的量效關系。在測定濃度范圍內，猴頭菇乙醇提取物OH-的清除能力始終強于熱水提取物，在質量濃度為0.5 mg/mL時，乙醇提取物對OH-的清除能力與抗壞血酸十分接近，兩者沒有顯著性差異（p＞0.05）。在質量濃度范圍為1.00～3.00 mg/mL時，乙醇提取物、熱水提取物與陽性對照之間存在顯著差異（p＜0.05），抗壞血酸OH-清除能力始終為最高水平。當猴頭菇提取物質量濃度為3.00 mg/mL時，抗壞血酸、乙醇提取物、熱水提取物對OH-清除率分別為54.9%，46.1%和41.7%，均表現出了較強的OH-清除能力。綜合來看，抗壞血酸OH-清除能力最優，乙醇提取物第二，熱水提取物第三。

圖3 猴頭菇提取物OH-清除率

2.6 猴頭菇提取物抗癌能力評價

如圖4所示，猴頭菇提取物對于HepG2的抑制效果都有良好表現，而且兩種溶劑提取物的抑制效果都隨著樣液濃度的升高而升高，有劑量依賴性。在樣液質量濃度為0.5 mg/mL時，乙醇提取物與5-FU的抑制率非常接近，兩者之間沒有顯著性差異（p＞0.05），且其抑制率顯著優于熱水提取物（p＜0.05），當樣液質量濃度為1.00 mg/mL時，乙醇提取物和熱水提取物的抑制率之間沒有顯著性差異（p＞0.05），當樣液質量濃度達到2.00 mg/mL時，兩者之間重新表現出顯著的差異（p＜0.05）。從整體上看，乙醇提取物對于HepG2細胞的抑制效果比熱水提取物的抑制效果更好。

圖4 猴頭菇提取物對HepG2的抑制率

如圖5所示，在提取物質量濃度為0.1 mg/mL時，乙醇提取物對HT29的抑制效果優于熱水提取物的抑制效果，但當樣液質量濃度為0.5 mg/mL時，熱水提取物的抑制效果超過了乙醇提取物的抑制效果，且與Mat的抑制率接近，乙醇提取物和熱水提取物之間沒有顯著性差異（p＞0.05）。隨著后續濃度逐漸升高，乙醇提取物重新表現出優于熱水提取物的效果。整體來看，熱水提取物和乙醇提取物的抑制效果均是隨著提取物濃度的升高而表現得更好，但是增長幅度逐漸趨于平穩。從整體上看，對于HT29細胞的抑制效果，乙醇提取物要比熱水提取物好。

圖5 猴頭菇提取物對HT29的抑制率

3 結論

猴頭菇提取物對DPPH自由基、ABTS自由基和羥基自由基都有良好的自由基清除能力。在兩種提取物中，乙醇提取物的抗氧化能力更好，這一結果可能與提取物中酚類物質的含量、種類和組成比例有關。猴頭菇提取物同時表現出了良好的抗癌活性。抗癌性與提取物濃度呈明顯的量效關系。除熱水提取物在抑制HT29細胞試驗中，質量濃度為0.5 mg/mL時抑制率超過了乙醇提取物外，乙醇提取物均表現出更好的抗癌性。

綜上所述，猴頭菇具有作為天然抗氧化劑以及天然抗癌的良好的發展潛力，文章研究結果可為進一步分離和純化猴頭菇中的抗氧化和癌性物質，以及綜合開發利用猴頭菇提供理論依據。