新型心肌黃酶檢測熒光探針的合成及生物成像

周 瑩，房街芹，賈明軒，朱立平

(云南大學化學科學與工程學院，云南 昆明 650091)

我國是惡性腫瘤的高發(fā)國家，對癌癥的監(jiān)測與治療一直是醫(yī)學相關研究領域的重點方向。分子氧是好氧生物中一種重要代謝產(chǎn)物，對于維持細胞的生命活動具有十分重要的意義[1]。當組織氧供應受限制時，會發(fā)生低氧現(xiàn)象，導致依賴氧氣的生理過程發(fā)生顯著變化。由于癌細胞以極快的速度不停生長，其內(nèi)部需氧量遠遠超出血液的供應量，極易導致組織內(nèi)部出現(xiàn)低氧[2]。在固體腫瘤內(nèi)，低氧導致部分酶出現(xiàn)過表達現(xiàn)象，其中硝基還原酶、偶氮還原酶及心肌黃酶的濃度變化最為明顯[3]。

心肌黃酶(DT-diaphorase)，簡稱DTD，是一種細胞質(zhì)黃素蛋白酶[4]。由于心肌黃酶在癌細胞中的表達量是在正常細胞中的2～50倍，因此心肌黃酶可用作癌癥的生物標志物及熒光探針目標的檢測物[5]。鑒于心肌黃酶檢測的重要性，開發(fā)心肌黃酶含量檢測方法及心肌黃酶高表達區(qū)域定位技術十分重要，也受到了國內(nèi)外科學家的廣泛關注。

有機小分子熒光探針，由于其具有多樣性的結構、可調(diào)控的光譜性質(zhì)及對識別物具有高選擇性、高靈敏度響應等特點，已逐漸成為廣泛應用于生物小分子檢測的主要研究手段和工具[6,7]。但目前已有的心肌黃酶探針中普遍存在發(fā)射波長較短、響應時間長、選擇性低等問題，這嚴重影響了心肌黃酶熒光探針的準確性和靈敏性[8]。結合專一性識別模式，引入發(fā)射波長較長的熒光團母體，利用新型光學成像技術，開發(fā)快速、準確的心肌黃酶檢測探針，用于細胞內(nèi)低氧水平的檢測、輔助惡性腫瘤的早期診斷，是我們近期的工作重點，具有十分重要的理論及臨床意義[3,9,10]。

本研究選擇尼羅紅類衍生物作為熒光基團，通過酯鍵或酰胺鍵的連接方式與識別基團三甲基苯醌相連[11]，設計了“off-on”型響應探針Milla 1。其探針具有良好的光穩(wěn)定性和光響應性，當與心肌黃酶反應后，可觀察到635 nm處發(fā)射峰熒光強度增加約4.4倍。探針Milla 1對心肌黃酶的檢測表現(xiàn)出檢測限低、反應時間短、選擇性強等特點。因此，探針Milla 1被成功應用于HeLa細胞和秀麗隱桿線蟲內(nèi)源性和外源性的心肌黃酶檢測中，證明了Milla 1是一個良好的心肌黃酶檢測探針。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑與儀器

實驗中所提及的和所使用的所有藥品試劑均為市售分析純，購買后不需要任何處理可直接用于實驗[12]。心肌黃酶(DTD)采購于上海源葉科技有限公司，S1007-2 KU(20 mg)。使用梅特勒托利AB204-N分析天平進行稱量，使用布魯克DRX 500核磁共振儀通過1H-NMR和13C-NMR確定合成的探針，使用Agilent100LC/MSD TOF高分辨質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析驗證，使用島津UV-240IPC紫外可見分光光度計進行紫外光譜測試，使用F97XP熒光可見分光光度計進行熒光光譜測試，使用Olympus FV-10i激光共聚焦顯微鏡進行細胞成像實驗，最后的秀麗隱桿線蟲熒光成像是通過Olympus BX51熒光正置顯微鏡進行測試的。

1.2 探針Milla 1的合成

化合物MA的合成步驟：冰浴條件下將化合物1(4.35 g，26.4 mmol)溶于15 mL濃鹽酸和5 mL水的混合物中，取亞硝酸鈉(2.18 g，31.6 mmol)溶于15 mL水并分批滴加到反應體系中，室溫反應2 h。得棕色固體MA，產(chǎn)物不穩(wěn)定，不需純化直接進行下一步反應。

化合物XD3的合成步驟：氮氣保護下，將MA和1，6-二羥基萘(2 g，12.5 mmol)溶于30 mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，140 ℃回流4 h，冷卻至室溫。層析柱法純化(二氯甲烷(DCM)：乙酸乙酯=10:1)得深綠色固體XD3，產(chǎn)率50%。

化合物MG，MH的合成步驟詳見參考文獻[2,12-16]。

探針Milla 1的合成步驟：取化合物XD3(170 mg，0.5 mmol)和化合物MH(125 mg，0.5 mmol)溶于30 mL無水DCM中，加入催化劑4-二甲氨基吡啶(DMAP)(30 mg，0.25 mmol)，室溫反應1 h后，向反應體系加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)(145 mg，0.75 mmol)，室溫過夜反應。層析柱法純化(石油醚：DCM=1:3)，得深紫色固體Milla 1，產(chǎn)率75%。1H-NMR(400 MHz，氘代氯仿(CDCl3))：δ8.30～8.27(d，J=8.8 Hz，1 H)，8.20(d，J=2.0 Hz，1 H)，7.59～7.57(d，J=9.2 Hz，1 H)，7.25～7.23(t，J=4.4 Hz，1 H)，6.68～6.65(m，6 H)，6.45(d，J=2.0 Hz，1 H)，6.34(s，1 H)，3.49～3.43(m，4 H)，2.20～2.18(d，J=8.3 Hz，3 H)，1.97(s，3 H)，1.92(s，3 H)，1.65(s，2 H)，1.56(s，2 H)，1.27～1.24(t，J=7.0 Hz，6 H)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)：δ 12.31，12.75，14.56，29.14，38.57，45.28，47.97，96.41，105.64，110.04，116.39，123.55，125.06，127.77，129.65，131.38，133.83，138.88，139.15，139.44，143.03，147.07，151.15，152.00，152.47，153.03，171.21，182.90，187.53，191.11。HEMS(ESI)：C34H34N2O6，通過計算得[M+H]+=567.249，實測值：m/z=567.249。

合成路線如圖1所示。

圖1 探針Milla 1合成路線

1.3 光譜測試

1.4 細胞、線蟲成像實驗

內(nèi)源性心肌黃酶實驗方法：在細胞中加入抗氧化劑谷胱甘肽乙基酯，濃度分別為0，0.4，0.8和1.2 mg·mL-1。在37 ℃恒溫的二氧化碳真空干燥箱中孵育2 h，用PBS緩沖液清洗干凈后，加入探針Milla 1母液10 μmol，于原條件下孵育2 h后，繼續(xù)用PBS緩沖液清洗干凈，再分別加入20 μL的DAPI(4’，6-二脒基-苯基吲哚)試劑恒溫孵育30 min。待測細胞繼續(xù)用PBS緩沖液清洗干凈，在共聚焦顯微鏡上進行細胞成像。

外源性心肌黃酶實驗方法：在細胞培養(yǎng)皿中分別加入心肌黃酶活力單位為0，15，30和65 μ·mL-1于37 ℃恒溫的二氧化碳真空干燥箱中孵育2 h后，用PBS緩沖液清洗干凈，再分別加入探針Milla 1母液和NADH溶液，使細胞中探針濃度保持在20 μmol，NADH濃度保持在0.5 mmol，繼續(xù)于原條件下孵育2 h后，用PBS緩沖液沖洗干凈，再次分別加入20 μL的DAPI試劑，繼續(xù)恒溫孵育30 min。待測細胞用PBS緩沖液清洗干凈，在共聚焦顯微鏡上進行細胞成像。

在培養(yǎng)線蟲的試管中分別加入活力單位為0，30和65 μ·mL-1的心肌黃酶，在37 ℃恒溫的二氧化碳真空干燥箱中孵育2 h后，用PBS緩沖液清洗干凈后，加入探針Milla 1母液(20 μmol)和NADH(0.5 mmol)，之后繼續(xù)在37 ℃恒溫的二氧化碳真空干燥箱中孵育2 h。待測試線蟲用PBS緩沖液清洗后，在熒光正置顯微鏡上進行生物成像。

2 結果與討論

2.1 探針Milla 1對心肌黃酶的紫外光譜測試

探針Milla 1對心肌黃酶的紫外滴定使用島津UV-240IPC紫外可見分光光度計進行測定。我們利用DMSO/PBS(1/1，V/V，pH=7.4)作為測試體系，在外源性加入NADH(0.5 mmol)的條件下研究了Milla 1和心肌黃酶的紫外可見光譜的變化，其紫外可見吸收光譜如圖2(A)所示。探針Milla 1在560 nm處有一個吸收峰，隨著心肌黃酶的不斷加入，當酶的活力達到65 μ·mL-1時，吸收光譜藍移至550 nm處，強度無明顯變化，測試體系達到飽和。

2.2 探針Milla 1對心肌黃酶的熒光光譜測試

隨后，我們對Milla 1和心肌黃酶的反應進行了熒光光譜研究(DMSO/PBS=1/1，V/V，pH=7.4，激發(fā)波長：585 nm，狹縫寬度：5 nm×5 nm，電壓：700 V)。如圖2(B)所示，隨著不同酶活力單位的心肌黃酶的加入，在最大發(fā)射波長635 nm處的熒光值不斷增加，當心肌黃酶的酶活力達到65 μ·mL-1時，熒光強度增加了約4.4倍后，不再發(fā)生變化。以上光譜實驗結果證明，Milla 1可用于心肌黃酶含量變化的熒光光學檢測。

λ/nm

2.3 探針Milla 1對心肌黃酶的檢出限測試

接下來，我們進行了Milla 1和心肌黃酶(DMSO/PBS=1/1，V/V，pH=7.4)的反應檢出限測試。如圖3(A)所示，在心肌黃酶濃度范圍為0～8 μ·mL-1時，熒光發(fā)射強度具有良好的線性關系(R2=0.9699)。基于國際純粹與應用化學聯(lián)合會(IUPAC)規(guī)定的檢出限(LOD)公式LOD=3σ/k[17-18]，(σ表示空白試驗的標準偏差，k表示熒光強度與心肌黃酶濃度之間校準曲線的斜率)。計算可得到，該反應檢測限為0.4 μ·mL-1。以上檢測限數(shù)值表明，Milla 1對心肌黃酶的檢測具有較高的靈敏度。

2.4 探針Milla 1的熒光選擇和紫外選擇性光譜測試

DTD/μ·mL-1

2.5 探針Milla 1對心肌黃酶的響應時間測試

我們分別對探針Milla 1和不同濃度心肌黃酶(0，65 μ·mL-1)在60 min反應內(nèi)，635 nm處的熒光值進行了測試。如圖3(D)所示，探針Milla 1在沒有DTD時，635 nm處的熒光強度沒有變化；在65 μ·mL-1心肌黃酶的作用下，可以發(fā)生斷鍵反應，釋放出熒光團，引起635 nm處的熒光值增強。反應進行20 min后，635 nm處的熒光強度趨近于平穩(wěn)不再改變。因此，我們可以推測探針Milla 1與心肌黃酶的反應時間約為20 min。

2.5 探針Milla 1對心肌黃酶的反應機理

在NADH的存在下，探針Milla 1與心肌黃酶發(fā)生還原反應及質(zhì)子化，使反應基團苯醌變?yōu)閷Ρ蕉?或半醌)，利用斷鍵反應釋放出熒光團XD3，實現(xiàn)對心肌黃酶的光學檢測。如圖4(A)為探針Milla 1與心肌黃酶反應的機理圖。如圖4(B)所示，探針分子離子峰為[M+H]+：567.249，加入心肌黃酶反應后，該探針分子離子峰消失，同時檢測到斷鍵反應后的熒光團分子離子峰[M+H]+：335.1389(圖4(C))。以上質(zhì)譜數(shù)據(jù)證明了我們提出的反應機理是正確。

圖4 (A)探針Milla 1與心肌黃酶(DTD)反應的機理圖。(B)探針Milla 1與心肌黃酶(DTD)反應前的高分辨質(zhì)譜圖。(C)探針Milla 1與心肌黃酶(DTD)反應后的高分辨質(zhì)譜圖。

2.7 探針Milla 1對心肌黃酶的細胞毒性測試

為研究探針在生物體內(nèi)的毒性情況，我們對探針進行了不同癌細胞和人正常細胞內(nèi)的毒性測試。如圖5所示，在探針濃度為40 μmol時，探針Milla 1對肺癌A549、肝癌SMMC-7721、宮頸癌Hela、乳腺癌MCF-7和結腸癌SW480的體外腫瘤和人正常肺上皮細胞BEAS-2B的體外生長均未達到半數(shù)抑制活性。以上實驗證明，探針Milla 1對癌細胞和人正常細胞的毒性均較小。

圖5 探針Milla 1對癌細胞A549、SMMC-7721、Hela、SW480、MCF-7和人正常細胞BEAS-2B的毒性測試圖

2.8 探針Milla 1對心肌黃酶的細胞成像測試

我們利用宮頸癌Hela細胞，進行了光學成像實驗，探索了探針Milla 1對內(nèi)源性和外源性的心肌黃酶的光學響應及檢測能力。由于抗氧化劑谷胱甘肽乙基酯孵育的Hela細胞會呈現(xiàn)低氧狀態(tài)，其自身會產(chǎn)生一定量的心肌黃酶。如圖6(A)所示，在內(nèi)源性心肌黃酶成像實驗中，隨著加入的抗氧化劑(谷胱甘肽乙基酯)的量增加，細胞內(nèi)低氧程度逐漸加強，細胞內(nèi)也呈現(xiàn)明顯的熒光增強梯度性變化現(xiàn)象。由此可知，探針Milla 1可以通過熒光成像的方法檢測細胞內(nèi)源性心肌黃酶含量變化并反映出相關區(qū)域的低氧程度。如圖6(B)所示，在細胞外源性心肌黃酶成像中，加入不同酶活力的心肌黃酶后，探針也可以在細胞內(nèi)呈現(xiàn)明顯梯度性熒光增強現(xiàn)象。因此我們認為，通過探針Milla 1熒光強度的變化可以檢測出細胞內(nèi)源性和外源性的心肌黃酶含量波動，進而反映出相關區(qū)域低氧程度。(圖6(C)、(D))

圖6 (A)探針Milla 1(20 μmol)在Hela細胞中的內(nèi)源性心肌黃酶的熒光成像，(B)探針Milla 1(20 μmol)在Hela細胞中的外源性心肌黃酶的熒光成像。(a)為明場(白光)通道；(b)為探針Milla 1(紅光)通道；(c)為DAPI核染色(藍光)通道；(d)為前三個通道的疊加圖。(C)探針Milla 1內(nèi)源性心肌黃酶熒光強度值。(D)探針Milla 1外源性心肌黃酶熒光強度值。

2.9 探針Milla 1對心肌黃酶的秀麗隱桿線蟲熒光成像測試

除此之外，我們利用探針Milla 1，以秀麗隱桿線蟲為生物模型，再次測試其在生物體中對心肌黃酶檢測及成像的可能性。如圖7(A)所示，在秀麗隱桿線蟲進行外源性心肌黃酶和探針Milla 1孵育后，隨心肌黃酶濃度的增加，線蟲體內(nèi)呈現(xiàn)梯度性的紅色熒光增強現(xiàn)象。(圖7(B))由此可見，探針Milla 1可成功用于秀麗隱桿線蟲外源性心肌黃酶檢測和光學成像實驗中。

圖7 (A)探針Milla 1(20 μmol)在NADH(0.5 mmol)存在下，通過心肌黃酶孵育的線蟲的活體熒光成像圖。(a1)、(b1)和(c1)為明場(白光)通道，(a2)、(b2)和(c2)為探針Milla 1(紅光)通道。(B)探針Milla 1在不同濃度下的平均熒光強度值

3 結論

綜上所述，我們設計合成了基于二甲基苯醌識別機理的新型熒光探針Milla 1，并將其應用于心肌黃酶的體內(nèi)及體外檢測中。探針Milla 1表現(xiàn)出對心肌黃酶的快速專一性識別，Milla 1對心肌黃酶的檢測具有檢測限低和選擇性高等優(yōu)點。HeLa細胞和線蟲成像實驗表明，Milla 1可以檢測到內(nèi)源性和外源性心肌黃酶含量的變化，進而對相關生物體內(nèi)低氧程度進行光學監(jiān)測，具有良好的應用前景。我們希望本文的有機合成和測試能夠為以后的心肌黃酶檢測用熒光探針設計和合成提供幫助。