CASR/VDR/PTH1R 信號(hào)通路在含鈣腎結(jié)石發(fā)生機(jī)制中的初步研究

李靜玲，柯坤彬，王振丞，秦德強(qiáng)，李 顥

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 泌尿外科，云南 昆明 650032）

高鈣尿及低枸櫞酸尿是含鈣腎結(jié)石的最重要因素[1]。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)CASR（鈣敏受體）和VDR（維生素D 受體）基因多態(tài)性與含鈣腎結(jié)石的形成相關(guān)[2-3]。另外有研究發(fā)現(xiàn)PTH 可與G 蛋白偶聯(lián)受體PTH1R（重組人甲狀旁腺激素1 受體）結(jié)合，通過(guò)P38α-MAPK 信號(hào)通路調(diào)節(jié)VDR 的水平[4]。但是既往研究CASR、VDR 和PTH1R 主要參與腫瘤等代謝性疾病之中[5-6]，在尿石癥中的研究主要集中在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物模型[7-8]。我們此次課題通過(guò)對(duì)腎結(jié)石患者（實(shí)驗(yàn)組）及腫瘤患者（對(duì)照組）正常腎髓質(zhì)進(jìn)行qPCR、WB 實(shí)驗(yàn)及免疫熒光實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了CASR、VDR、PTH1R 基因在人體腎髓質(zhì)中表達(dá)，且實(shí)驗(yàn)組CASR、VDR蛋白的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組PTH1R蛋白的表達(dá)水平低于對(duì)照組。于是我們首次提出了CASR 和VDR 基因可能通過(guò)PTH1R 信號(hào)通路參與了人體內(nèi)含鈣腎結(jié)石的發(fā)生機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本

選取2020 年9 月至2021 年10 月在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院13 例單側(cè)腎癌在手術(shù)時(shí)獲得了新鮮的正常腎髓質(zhì)10 mg 為對(duì)照組，15 例結(jié)石導(dǎo)致積水腎行單側(cè)腎切除術(shù)時(shí)獲得新鮮腎髓質(zhì)10 mg 為實(shí)驗(yàn)組。這些患者除外結(jié)核、近期服用糖皮質(zhì)激素或雄激素及甲狀旁腺功能亢進(jìn)等代謝性疾病患者，該研究符合赫爾辛基宣言的標(biāo)準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均為自愿參加本次研究，并簽署知情同意書(shū)，本研究承諾對(duì)研究對(duì)象的個(gè)人信息嚴(yán)格保密。筆者收集了患者的臨床資料，包括：年齡、性別、腫瘤大小，結(jié)石大小及位置、結(jié)石成分分析結(jié)果（其中13 例為草酸鈣腎結(jié)石，1 例為磷酸鈣結(jié)石，1 例為碳酸磷灰石），影像學(xué)CT、B 超、ECT 等資料、診斷時(shí)的腎功能、Ca2+水平。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量Q-PCR應(yīng)用微量RNA 提取試劑盒（天根）提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組病人腎髓質(zhì)的總RNA，使用分光光度法測(cè)定提取的RNA 的量和純度，通過(guò)每個(gè)樣品中使用2 μg RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用SYBR qPCR Master Mix（Q712-02）測(cè)定CASR、VDR 的mRNA 表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.2 蛋白質(zhì)免疫印跡（western-blot）取積水腎腎髓質(zhì)組織為實(shí)驗(yàn)組，腎腫瘤周邊正常腎髓質(zhì)組織樣本為對(duì)照組，分別把組織剪成細(xì)小的碎片，持續(xù)液氮充分研磨組織至粉末狀，按照每20 mg組織加入200 μL 高效RIPA 組織裂解液（Solarbio，4 ℃保存），按每1 mL RIPA 加入10 μL PMSF（-20 ℃保存），冰上裂解30 min，裂解后樣品離心3 min（12 000 g），取上清，加4×上樣緩沖液，煮沸10 min，待冷卻后上樣。配制10%的SDSPAGE 膠，按照maker、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行上樣，每孔上樣15 μL 蛋白，5 U maker，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h 后，SDS-PAGE 加入相應(yīng)的一抗鼠抗CaSR 抗體（Santacruz，1∶1 000）、一抗鼠抗；VDR（Proteintech，1∶5 000）、一抗兔抗；PTH1R（Santa SC-12722，1∶1 000）、一抗兔抗，均以GAPDH 作內(nèi)參（abmart P30008M，1∶2 000）。均用TBST 洗滌3 次，每次10 min。加入相應(yīng)二抗（CST 7074，CST 7076，1∶2 000），37℃孵育2 h，用TBST 洗膜3 次，每次10 min，用ECL 發(fā)光法檢測(cè)目的條帶的表達(dá)，用imagej win 64 軟件分析內(nèi)參，調(diào)整內(nèi)參一致。抗體序列見(jiàn)表2。

表2 抗體序列表Tab.2 Antibody sequence

1.2.3 免疫熒光免疫熒光從外科手術(shù)獲得的福爾馬林固定的石蠟包埋的組織樣品用于免疫熒光。將5 μm 厚的切片安裝在涂有聚賴氨酸包被的載玻片上，用二甲苯脫蠟，并通過(guò)梯度乙醇溶液再水化成蒸餾水。PBS 漂洗，抗原修復(fù)，將切片浸入pH=6.0 的檸檬酸鹽緩沖液中，微波加熱至沸騰，中檔微波處理10 min，自然泠卻。5%羊血清封閉，室溫60 min。加合適濃度的一抗（CASR、VDR、PTH1R），4 ℃冰箱過(guò)夜。PBST 漂洗，加二抗山羊抗小鼠IgG H&L（Cy3 ?）于組織上進(jìn)行標(biāo)記，避光，37 ℃，1 h。PBST 漂洗，吸去多余的水分，每個(gè)組織上滴加50 μL 左右的抗淬滅封片劑（含DAPI）封片，使用丹吉爾全息掃描顯微鏡下觀察，掃描。使用Case Viewer 軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用IBM SPSS Statistics 25 進(jìn)行軟件分析，CASR、VDR、PTH1R 的mRNA 的相對(duì)水平表示為平均標(biāo)準(zhǔn)偏差，通過(guò)非參數(shù)檢驗(yàn)檢測(cè)積水腎與腎腫瘤臨近正常腎髓質(zhì)間CASR、VDR 和PTH1R表達(dá)水平的差異性。為了評(píng)估CASR、VDR、PTH1R 表達(dá)及臨床病理變量之間的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分為兩組，上調(diào)和下調(diào)。當(dāng)積水腎腎髓質(zhì)組織中CASR mRNA 水平高于腎腫瘤臨近正常腎髓質(zhì)組織時(shí)，可認(rèn)為CASR mRNA 表達(dá)在積水腎中上調(diào)，否認(rèn)可認(rèn)為下調(diào)。臨床病理特征和CaSR、VDR、PTH1R 等基因表達(dá)之間的聯(lián)系用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 積水腎腎髓質(zhì)組織中及腎腫瘤正常腎髓質(zhì)組織

積水腎腎髓質(zhì)組織中及腎腫瘤正常腎髓質(zhì)組織中的CASR、VDR、PTH1R 等mRNA 表達(dá)，筆者使用了q-PCR 每個(gè)樣本，繪制出qPCR 箱線。

CASR、VDR、PTH1R 等在腎髓質(zhì)中表達(dá)的QPCR 差異性箱線圖見(jiàn)圖1。研究人群分為2 組，腎腫瘤患者為對(duì)照組，腎結(jié)石患者為實(shí)驗(yàn)組。q-PCR 結(jié)果提示CASR、PTH1R 基因 mRNA 在積水腎髓質(zhì)及腎腫瘤正常髓質(zhì)表達(dá)水平的差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。VDR 的mRNA 在積水腎髓質(zhì)及腎腫瘤正常髓質(zhì)表達(dá)水平的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 CASR、VDR、PTH1R 的q-PCR 箱線圖Fig.1 Q-PCR box plot of CASR，VDR，PTH1R

2.2 腎實(shí)體髓質(zhì)組織中的CASR、VDR、和PTH1R 基因

筆者對(duì)每一個(gè)腎實(shí)體髓質(zhì)組織中的CASR、VDR、和PTH1R 基因均進(jìn)行了WB，其中CASR、VDR、PTH1R 均出現(xiàn)了目的蛋白條帶的表達(dá)，見(jiàn)圖2。

CASR、VDR、PTH1R 基因在積水腎髓質(zhì)及腎腫瘤正常髓質(zhì)蛋白質(zhì)差異性表達(dá)的WB（Western Blot）。其中1，3，5=對(duì)照組（腎腫瘤正常腎髓質(zhì)樣本），2，4，6=實(shí)驗(yàn)組（積水腎腎髓質(zhì)組織樣本），GAPDH 為內(nèi)參。可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組腎結(jié)石患者的CASR、VDR 基因的表達(dá)較對(duì)照組腎腫瘤患者上調(diào)，而PTH1R 基因表達(dá)下調(diào)，見(jiàn)圖2。

圖2 CASR、VDR、PTH1R 的蛋白質(zhì)免疫印跡圖Fig.2 Western blot of CASR，VDR，and PTH1R

2.3 CASR、VDR 和PTH1R 基因在腫瘤正常腎實(shí)體組織和積水腎實(shí)體組織中的表達(dá)

筆者的實(shí)驗(yàn)對(duì)CASR、VDR 和PTH1R 基因在腫瘤正常腎實(shí)體組織和積水腎實(shí)體組織中的表達(dá)做了免疫熒光標(biāo)記，筆者的免疫熒光結(jié)果證實(shí)了CASR、VDR 和PTH1R 在腎實(shí)體髓質(zhì)組織中均有表達(dá)，見(jiàn)圖3。

CASR 基因表達(dá)的免疫熒光圖3 顯示，其中DAPI 核染為藍(lán)色，紅色為蛋白的陽(yáng)性表達(dá)。可見(jiàn)CASR 基因在腎組織的髓質(zhì)和皮質(zhì)部的腎小管上皮細(xì)胞中均有表達(dá)，主要定位于腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)中。其中CARS 蛋白腎腫瘤患者髓質(zhì)部和皮質(zhì)部的表達(dá)差異不明顯，而在積水腎組中髓質(zhì)部的表達(dá)強(qiáng)度及表達(dá)量較皮質(zhì)部的高，見(jiàn)圖3。

圖3 CASR 免疫熒光圖（×400）Fig.3 Immunofluorescence images of CASR（×400）

VDR 基因表達(dá)的免疫熒光見(jiàn)圖4，其中DAPI 核染為藍(lán)色，紅色為蛋白的陽(yáng)性表達(dá)。VDR 主要定位于足細(xì)胞及腎近端小管，在腎腫瘤及腎積水患者皮質(zhì)及髓質(zhì)均有表達(dá)，且腎積水患者皮質(zhì)髓質(zhì)表達(dá)均高于腎腫瘤患者，見(jiàn)圖4。

圖4 VDR 免疫熒光圖（×400）Fig.4 Immunofluorescence images of VDR（×400）

PTH1R 基因表達(dá)的免疫熒光圖5 顯示其中DAPI 核染為藍(lán)色，紅色為蛋白的陽(yáng)性表達(dá)。PTH1R 主要位于腫瘤患者的遠(yuǎn)端小管，積水腎患者的近端小管，其中髓質(zhì)表達(dá)高于皮質(zhì)，且在髓質(zhì)組織中呈現(xiàn)出逐漸遞增的趨勢(shì)，在皮質(zhì)組織中呈現(xiàn)出逐漸遞減的趨勢(shì)。在腫瘤腎組織中皮質(zhì)與髓質(zhì)均為高表達(dá)，而在積水腎中可見(jiàn)髓質(zhì)與皮質(zhì)均為低表達(dá)，見(jiàn)圖5。

圖5 PTH1R 免疫熒光圖（×400）Fig.5 Immunofluorescence images of PTH1R（×400）

3 討論

在本研究中，筆者首次證實(shí)了CASR、VDR、PTH1R 基因在腎結(jié)石患者及腎腫瘤正常腎髓質(zhì)組織的mRNA 及蛋白質(zhì)表達(dá)水平。此外，通過(guò)WB（Western Blot）實(shí)驗(yàn)筆者證實(shí)了CASR、VDR 腎結(jié)石患者CASR、VDR 上調(diào)，PTH1R 下調(diào)，并通過(guò)免疫熒光標(biāo)記進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證。

CASR 基因是參與體內(nèi)高鈣尿代謝、VDR 基因是參與體內(nèi)枸櫞酸鹽代謝的關(guān)鍵基因。CASR被證實(shí)能夠通過(guò)絡(luò)合鈣抑制腎近端小管中二羧酸鹽和檸檬酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而降低含鈣腎結(jié)石的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，而尿液中羧酸鹽和檸檬酸鹽的增加會(huì)增加尿草酸鈣的飽和度從而形成草酸鈣結(jié)石[3]。VDR 影響NaDC1 的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，導(dǎo)致腎近曲小管對(duì)枸櫞酸的重吸收增加，進(jìn)而導(dǎo)致高鈣尿的發(fā)生[4]。CASR 和VDR 相關(guān)信號(hào)可以被不同的刺激因素激活或抑制，形成各自相關(guān)的信號(hào)通路，激活或抑制不同的轉(zhuǎn)錄因子、底物蛋白，介導(dǎo)不同的生物學(xué)功能效應(yīng)。血清鈣能刺激CASR 增加claudin-14 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制claudin-16/claudin-19 結(jié)合形成的鈣通道，從而減少細(xì)胞旁路中鈣的重吸收[4]。PTH（甲狀旁腺激素）和低磷血癥能刺激VD 的活性形式1，25-二羥維生素D3 的生成，1，25-二羥維生素D3 通過(guò)血流入腸道內(nèi)與VDR（維生素D 受體）結(jié)合，增加鈣的吸收[9]。當(dāng)體內(nèi)血清鈣上升時(shí)，CASR 被激活，增加PTH 分泌，后者又反過(guò)來(lái)作用于1，25-二羥維生素D3，導(dǎo)致鈣磷的濾過(guò)負(fù)荷增加。而PTH增加鈣的重吸收，磷的排泄，使血清鈣升高，而后者又可抑制PTH 和1，25-二羥維生素D3 的合成[10]。

CASR、VDR 的mRNA 在腎結(jié)石積水患者中較腎腫瘤患者中趨于上調(diào)，相反，PTH1R 的mRNA 的表達(dá)趨于下調(diào)，我們使用WB 與免疫熒光亦證實(shí)了CASR、VDR 的上調(diào)及PTH1R 的下調(diào)。這與既往國(guó)內(nèi)外研究基本一致。

CASR 可與配體鈣結(jié)合后一方面可通過(guò)Gαi/o 的G 蛋白信賴性途徑直接激活MAPK 和下調(diào)cAMP；另一方面可通過(guò)Gaq/11 途徑，調(diào)控IP3 和DAG 釋放信號(hào)，DAG 激活PKC 和Ras 后刺激P38-MAPK[17]。FGF23（成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子）通過(guò)磷酸化作用會(huì)抑制1α，25-dihydroxyvitamin-D 的合成，減少腸道對(duì)磷酸鹽的吸收，進(jìn)而減少體內(nèi)磷酸鈉鹽的水平，從而調(diào)節(jié)VDR 和磷酸鹽[18]。FGF-23 可以抑制MAPK/ ERK1/2 通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并加速PTH（甲狀旁腺激素）的分泌[19]。

既往研究已經(jīng)證明了腎中CASR、VDR、PTH1R 等基因的表達(dá)，然而這些研究集中在CASR、VDR 與胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌等腫瘤代謝性疾病相關(guān)聯(lián)[5,11-14]。另一方面?zhèn)戎赜谘芯緾ASR 依賴性抑制性支配的PTH 敏感性經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)途徑及細(xì)胞旁途徑關(guān)聯(lián)的鈣離子重吸收及分泌[15-16]。已有研究證實(shí) CASR、VDR 和PTH1R 在腎臟中定位表達(dá)，CASR 主要表達(dá)在近端小管刷狀緣的頂端膜上[22]，VDR 主要定位于足細(xì)胞及腎近端小管[23]。PTH1R 定位于腎小管S1 節(jié)段管腔表達(dá)[24]。然而它們使用的是HK-2 細(xì)胞以及大鼠等的腎組織，而不是人類組織，因此，筆者獲得的關(guān)于人類的CASR、VDR、PTH1R 在腎中表達(dá)的數(shù)據(jù)是有限的。而在本課題研究中，q-PCR 中筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅證實(shí)了VDR 的表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中的表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而CASR、PTH1R 基因的表達(dá)的差異性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與我們的WB 跟免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果稍有不同，我們的免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CASR、VDR 在上述部位的表達(dá)，稍有不同的是筆者還證實(shí)了PTH1R 不僅表達(dá)在近端小管，亦表達(dá)在遠(yuǎn)端小管。筆者的WB 跟免疫熒光均證實(shí)了CASR、VDR 等在腎結(jié)石患者中高表達(dá)，而PTH1R 低表達(dá)，q-PCR 出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)差異性的結(jié)果一方面可能與基因的轉(zhuǎn)錄后修飾及翻譯有關(guān)[20-21]，亦也可能由于我們的樣本量較少，我們未來(lái)將在此方面作更深一步的探索性研究。

CaSR、VDR、PTH1R 在含鈣腎結(jié)石進(jìn)展過(guò)程中的確切功能機(jī)制尚不清楚。需要進(jìn)一步的研究來(lái)揭示CaSR、VDR 表達(dá)參與含鈣腎結(jié)石的機(jī)制。我們的實(shí)驗(yàn)研究有一定的局限性，在分析結(jié)果時(shí)應(yīng)該綜合權(quán)衡考慮。一方面由于樣本數(shù)量相對(duì)較少，推斷結(jié)果時(shí)可能有一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。另一方面，結(jié)石導(dǎo)致積水腎性腎切除的患者，臨床上腎實(shí)質(zhì)較薄，皮質(zhì)髓質(zhì)界限難以分清，而選取腎腫瘤患者的正常腎髓質(zhì)為對(duì)照組而沒(méi)有選擇正常患者的腎髓質(zhì)，可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，主要是考慮到選取健康人的正常腎髓質(zhì)有違倫理，所以可能存在實(shí)驗(yàn)上的不足。而且我們沒(méi)有采取相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)確定CaSR、VDR、PTH1R 等基因在腎結(jié)石中的形成的機(jī)制。另外，疾病的遺傳異質(zhì)性、環(huán)境差異、激素在結(jié)石形成中的作用、種族特征、群體之間的差異性、對(duì)照組的選擇、基因與環(huán)境的作用有可能是導(dǎo)致結(jié)果的不同，筆者應(yīng)進(jìn)行增加臨床樣本量、進(jìn)一步的動(dòng)物模型及相關(guān)實(shí)驗(yàn)信號(hào)通路研究論證，以確認(rèn)積水腎樣本中CaSR、VDR、PTH1R 等表達(dá)的臨床病理特征。