促滲劑對八桂止痛乳膏體外經(jīng)皮吸收的影響

張錦麗 ，梅佳華 ，廖承成 ，胡 丹 ，黃 虹 ，李元文

（1）麗江市中醫(yī)醫(yī)院皮膚科，云南 麗江 674100;2）云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南 昆明 650500;3）云南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650021;4）北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院皮膚性病科，北京 100000）

八桂止痛乳膏（原名：消炎止痛散）是根據(jù)國家級名老中醫(yī)劉復(fù)興主任自創(chuàng)外用驗(yàn)方消炎止痛散優(yōu)化制作而來。其主要組成為桂枝、透骨草、三棱、莪術(shù)、八角楓、昆明山海棠、大黃，具有消炎止痛、活血化瘀之功效[1-2]。方中以桂枝為君藥。通過臨床隨機(jī)對照試驗(yàn)和小鼠模型的抗炎鎮(zhèn)痛作用實(shí)驗(yàn)[3]，表明抗炎鎮(zhèn)痛是此復(fù)方的一大特點(diǎn)，且散劑外用在多年的臨床運(yùn)用中，療效顯著，極大的減輕患者的疼痛。但該方在臨床應(yīng)用過程中仍有諸多不足，為提高患者治療疾病依從性，在傳統(tǒng)中醫(yī)基礎(chǔ)理論的指導(dǎo)下，應(yīng)用現(xiàn)代制藥技術(shù)不斷優(yōu)化處方及制備工藝，將此散劑改良為膏劑。前期課題中通過單因素及正交設(shè)計等方法已選出最佳基質(zhì)配方，現(xiàn)為提高中藥膏劑中有效成分透過皮膚，發(fā)揮更好的臨床療效，處方中加入適合的透皮吸收促滲劑是必不可少的。在便攜性和操作性上，進(jìn)行劑型轉(zhuǎn)化。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)研究，篩選出氮酮作為本實(shí)驗(yàn)促滲劑，制備含促滲劑的八桂止痛乳膏，使藥物更持久深層透過皮膚，觀察不同濃度的氮酮對八桂止痛乳膏的透皮吸收影響。但由于該中藥膏劑里中藥物成分復(fù)雜，部分有小毒，現(xiàn)階段難以做到對每種成分進(jìn)行可控性操作，所以選擇該方君藥主要成分桂皮醛作為體外經(jīng)皮實(shí)驗(yàn)的檢測目標(biāo)，用以測定有效成分的釋放量。為將來不斷開發(fā)臨床新藥與研究中醫(yī)藥提供思路及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1260 Series 高效液相色譜儀（安捷倫公司）；TK-12B 型透皮擴(kuò)散儀（上海市鍇凱科技貿(mào)易有限公司）；CP124C 電子天平（奧豪斯儀器有限公司）。

1.2 試藥

八桂止痛乳膏；桂皮醛標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院 批號為：110710-201821）；甲醇（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；石油醚（成都市科隆化學(xué)品有限公司）；75%乙醇（昆明遠(yuǎn)方制品生物有限公司）；生理鹽水（昆明南疆制藥有限公司），甲醇、石油醚均為分析純。

1.3 動物

昆明種小鼠，雄性，18～22 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號為SCXK（湘）2019-0004。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，以表示。

2 結(jié)果

2.1 HPLC 測定桂皮醛含量方法的建立

2.1.1 色譜條件色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；流動相為乙腈-水（32∶68）；檢測波長為290 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.1.2 對照品溶液制備取桂皮醛對照品，稱定，加甲醇制成每mL 含桂皮醛0.418 mg 的溶液，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備取1 g 八桂止痛乳膏于體外透皮擴(kuò)散池，取不同時間乳膏透過皮膚到接收介質(zhì)中的溶液，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 陰性樣品溶液的制備取桂枝陰性乳膏，按2.1.3 項(xiàng)下方法取接收介質(zhì)中的溶液，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.5 專屬性考察按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件，桂皮醛與其他組分色譜峰均達(dá)到基線分離，陰性樣品溶液無任何干擾，見圖1。

圖1 八桂止痛乳膏中桂皮醛HPLC 圖Fig.1 HPLC figure of Cinnamaldehyde in the Bagui Zhitong cream

2.1.6 線性關(guān)系考察精密稱取桂皮醛對照品適量分別配制成0.1045、0.209、0.418、0.836、1.672、2.09、4.18 μg/mL 系列對照品溶液，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測定不同濃度桂皮醛對照品溶液的峰面積，檢測結(jié)果見表1。對檢測結(jié)果進(jìn)行線性回歸，得到的線性回歸方程為，結(jié)果表明桂皮醛在0.104 5～4.18 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見圖2。

圖2 桂皮醛線性擬合結(jié)果Fig.2 Linear fitting results for cinnamaldehyde

表1 HPLC 測定桂皮醛含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab.1 The standard curve of Cinnamaldehyde content detected by HPLC

2.1.7 精密度實(shí)驗(yàn)分別取0.1045、0.418、4.18 μg/mL 的桂皮醛標(biāo)準(zhǔn)品溶液各3 份，共9 份樣品進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析，檢測樣品中桂皮醛的峰面積，結(jié)果顯示低、中、高濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液精密度的RSD 值分別為0.57%、0.27%、0.11%，表明該方法測定桂皮醛含量精密度良好，檢測結(jié)果見表2。

表2 桂皮醛含量測定精密度實(shí)驗(yàn)Tab.2 Precision test for determination of cinnamaldehyde content

2.1.8 穩(wěn)定性考察精密量取八桂止痛乳膏體外經(jīng)皮滲透液1.0 mL，0.22 μm 微孔濾膜過濾后分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測量樣品中桂皮醛的峰面積。結(jié)果顯示樣品穩(wěn)定性的RSD 值為2.80%，表明樣品在24 h 內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性，檢測結(jié)果見表3。

表3 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)Tab.3 Stability test of samples

2.1.9 重復(fù)性考察取八桂止痛乳膏體外經(jīng)皮滲透樣品6 份進(jìn)行重復(fù)性考察，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，檢測樣品中桂皮醛峰面積，結(jié)果顯示樣品重復(fù)性的RSD 值為2.47%，表明該方法測定樣品中桂皮醛含量重復(fù)性好，見表4。

表4 桂皮醛含量測定重復(fù)性試驗(yàn)Tab.4 Repeatability test of the determination of cinnamaldehyde content

2.1.10 加樣回收率精密量取八桂止痛乳膏體外經(jīng)皮滲透接收液樣品0.5 mL（含桂皮醛0.43 μg）9 份，分別加入低濃度、中濃度、高濃度的對照品溶液各3 份，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，檢測其加樣回收率。結(jié)果顯示低濃度、中濃度、高濃度的標(biāo)準(zhǔn)品分別加入到八桂止痛乳膏體外經(jīng)皮滲透液中，其桂皮醛的平均加樣回收率分別為102.79%、101.76%、100.70%，RSD 值分別為1.51%、1.87%、0.85%。加樣回收率計算公式為：加樣回收率=（C-A）/B×100%，其中A 為供試品中所含桂皮醛的含量；B 為對照品加入桂皮醛含量；C 為檢測到桂皮醛含量，見表5。

表5 加樣回收率的測定結(jié)果Tab.5 The determination results of sample recovery rate

2.2 體外經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)

2.2.1 離體小鼠皮膚的制備昆明種小鼠（18～20 g），雄性，共10 只。適應(yīng)性飼養(yǎng)24 h。將小鼠固定好，剃去腹部的長毛，然后再用脫毛膏將剩余短毛去除。將其脫頸椎處死后，即刻剪下小鼠去毛部位皮膚，反面平鋪，分離皮下組織及脂肪，0.9% 鹽水反復(fù)沖洗至干凈，0.9%鹽水中浸入無破損皮膚，在 -20 ℃冷凍保存，備用。

2.2.2 擴(kuò)散裝置與接收介質(zhì)的選擇取備用小鼠的皮膚并解凍，將其固定在TK-12B 型擴(kuò)散池的一端，使皮膚表層面向供給室，八桂止痛乳膏1 g精密稱取置于供給室中，與皮膚緊密接觸并涂抹均勻。注滿30%乙醇生理鹽水溶液至接收室中，使與真皮層緊密接觸，（37±0.5）℃，100 r/min 恒速磁力攪拌，分別在0.5，1，2，4，6，8，10，12，24 h 取樣3 mL，同時補(bǔ)充相等體積的接收液。用0.22 μm 微孔濾膜過濾樣品后，在高效液相色譜儀中注入10 μL，測定其含量，并按公式計算累積滲透量Q=（V總Cn+ΣCn-1V取）/A，其中，V總為擴(kuò)散池接收室的體積，Cn為第n 個取樣點(diǎn)測得的接收液中藥物濃度，Cn-1為第n-1 個取樣點(diǎn)測得的接收液中藥物濃度，V取為取樣體積，A 為滲透面積。以不同時間的Q 對t 作圖，并對作圖后直線部分的Q 對t 進(jìn)行線性回歸，所得斜率視為藥物的經(jīng)皮吸收速率Jss[μg/（cm2·h）]。增滲倍數(shù)ER=Jss含透皮吸收促進(jìn)劑/Jss空白。

2.2.3 八桂止痛乳膏的制備取桂枝粉碎成粗粉，加水浸泡12 h，采用蒸餾法提取揮發(fā)油，將揮發(fā)油加入無水硫酸鈉脫水。藥渣與其余5 味藥加水煎煮2 次，合并以上藥液，濃縮至相對密度1.20 g/mL（60 ℃）。取處方量硬脂酸、液狀石蠟、羊毛脂置容器內(nèi)，水浴加熱至融化；另取羥苯乙酯、蒸餾水、三乙醇胺、甘油置于其他容器中加熱溶解，再加入處方量的浸膏，攪拌均勻；在同等溫度下，將水液以細(xì)流均勻、緩慢加入到油液中，同時進(jìn)行攪拌，直至冷凝，即得八桂止痛乳膏。

2.2.4 不同氮酮濃度對八桂止痛乳膏體外經(jīng)皮滲透的影響制備含1%氮酮、3%氮酮、5%氮酮、7%氮酮、10%氮酮的八桂止痛乳膏，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行操作，以Q 對t 作圖，用以考察八桂止痛乳膏在不同氮酮濃度作用下的經(jīng)皮吸收滲透效果。結(jié)果表明，加入5%氮酮乳膏中桂皮醛的Q24和Jss最大，表明八桂止痛乳膏的Jss隨著氮酮濃度的增加先增大后減小。含不同濃度氮酮的八桂止痛乳膏累積釋放量數(shù)據(jù)見表6，Qt 圖見圖3，不同濃度氮酮對八桂止痛乳膏的促滲效果見表7。

表7 不同氮酮濃度對八桂止痛乳膏的促滲效果（n=3）Tab.7 Promoting effect of different concentrations of azone on transdermal permeation of Bagui zhitong cream（n=3）

圖3 不同氮酮濃度的八桂止痛乳膏Q-t 圖Fig.3 Q -t figure of different concentrations of azone BaGui Zhitong cream

表6 體外經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)累積釋放量（，n=3）Tab.6 The cumulative release amount of the experiment in vitro transdermal permeation（，n=3）

表6 體外經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)累積釋放量（，n=3）Tab.6 The cumulative release amount of the experiment in vitro transdermal permeation（，n=3）

3 討論

本研究結(jié)果示，不含有透皮吸收促進(jìn)劑的八桂止痛乳膏中，桂皮醛累積釋放量方程為Q=0.236 5 t+0.599 6，24 h 的Jss為0.24±0.09，加入不同濃度氮酮后Jss均有升高，提示氮酮可促進(jìn)桂皮醛透皮吸收，從促滲倍數(shù)可以看出，乳膏中加入氮酮后均不同程度促進(jìn)桂皮醛體外經(jīng)皮滲透，其中含5%氮酮的八桂止痛乳膏促滲效果最好，增滲倍數(shù)為陰性對照的2.125 倍。隨著氮酮濃度的不斷增加，透皮累積釋放量及經(jīng)皮吸收速率反而降低。氮酮濃度過高的八桂止痛乳膏黏稠性增加，可能對某些成分產(chǎn)生一定的抑制作用，不利于桂皮醛的釋放，進(jìn)一步降低了皮膚的水合作用，延緩了皮膚的吸收擴(kuò)散。

中藥軟膏的記載最早可見于《山海經(jīng)》中提及的“羯羊脂”，戰(zhàn)國時代也有記錄，如膏臊、豕膏等。廣泛應(yīng)用于皮膚美容、肛腸、骨傷科等各個方面。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為外用藥物是通過腠理、肌肉等途徑，其性味入臟腑，祛邪益氣扶正，達(dá)到治療效果，即“藥達(dá)病所，投之可至”[4]。從吸收角度而言，藥物經(jīng)過皮膚的滲透作用，可以使藥效直達(dá)患處，局部血藥濃度在一段較長時段內(nèi)保持較高的水平，可通過皮下累積后緩慢釋放從局部到達(dá)全身作用[5]。皮膚科外用藥廣泛，劑型多樣化，表皮作為主要的藥物吸收途徑，同時皮膚角質(zhì)層要求藥物具有一定的溶脂性[6]，氮酮可增加角質(zhì)層細(xì)胞間的流動，降低藥物擴(kuò)散阻力，基于以上理論基礎(chǔ)，氮酮對親油、親水性藥物和活性成分等均有顯著的促滲作用，藥理活性很低，是一類評價較高的促滲劑[7-8]，并適用于成分復(fù)雜的中藥制劑，故本研究中選擇親脂性、親水性促滲劑氮酮是可行的。八桂止痛散是國家級名老中醫(yī)劉復(fù)興教授自創(chuàng)的經(jīng)驗(yàn)方，本方劉老常臨床常常用于治療帶狀皰疹、帶狀皰疹后神經(jīng)痛等各類皮膚痛證，可達(dá)到 消炎止痛、活血化瘀的效果。在云南省中醫(yī)醫(yī)院使用數(shù)十年，收到良好臨床療效，本課題組為進(jìn)一步增加八桂止痛散的臨床療效，對原有劑型進(jìn)行必要的改良，嘗試將散劑改進(jìn)為乳膏劑型，便于患者進(jìn)行使用，增加依從性。

促滲劑的應(yīng)用主要在于輔助載體增強(qiáng)其透皮作用[9-11]，有研究表明，聯(lián)合使用促滲劑可增加中藥透皮吸收效果。中藥劑型的改良是未來中醫(yī)藥發(fā)展的重要途徑。值得進(jìn)一步探索。但過于注重促滲效果時，可能會增加藥物本身的毒性、刺激性作用，給局部皮損帶來不必要的過敏反應(yīng)及其他不良反應(yīng)。故今后需要進(jìn)一步研究及觀察。本實(shí)驗(yàn)及前期實(shí)驗(yàn)中觀察到，八桂止痛散經(jīng)過劑型改良后，在止痛效果，起效時間等方面均顯示出良好的優(yōu)勢。經(jīng)皮給藥方法在藥物吸收過程中具有避免肝臟的首過消除效應(yīng)、延長有效作用時間、避免胃腸道的不良反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)[12]。但大部分中藥復(fù)方中成分復(fù)雜，就以此方來說，莪術(shù)、大黃中藥飲片中含有揮發(fā)油成分，本身也可促進(jìn)復(fù)方中其他成分的透皮吸收，而本次檢測內(nèi)容只選取桂皮醛，較為單一，難以真實(shí)的反映全方的促滲效果；且實(shí)驗(yàn)用離體皮膚的保存辦法、性質(zhì)及狀態(tài)對藥物的經(jīng)皮滲透效果影響較大[13]。無論在哪一種促進(jìn)藥物經(jīng)皮吸收的方法上，都在很大程度上的改變了表皮的選擇透過性，或打開了新的內(nèi)外連接渠道，或干擾皮膚角質(zhì)層的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，影響了表皮的屏障作用[14]。伴隨藥物理化性質(zhì)的不同，透過藥物濃度也不一致，同時也不可忽略皮膚角質(zhì)層的屏障功能與其年齡、性別、環(huán)境及部位的影響。

中醫(yī)外治理論歷史悠久，但中藥復(fù)方成分復(fù)雜，療效廣泛，如何增加中草藥中有效成分的透過，把握有效藥量的透過大小、持續(xù)時間，如何削弱有毒成分等，這些問題仍待解決。隨著國家對中醫(yī)藥的不斷重視，中醫(yī)藥現(xiàn)代化是我國中醫(yī)藥改革的必經(jīng)之路。中藥劑型需要不斷完善，經(jīng)皮給藥方法的越來越收到重視，并獲得越來越多的關(guān)注[15-17]。在中醫(yī)基礎(chǔ)知識的指導(dǎo)下，合理應(yīng)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)，探討化學(xué)或天然促滲劑及乳膏基質(zhì)對單味或復(fù)方中藥毒性、藥效增減的影響，中藥配伍中是否存在相互促滲的作用，對中藥藥物到達(dá)病所進(jìn)行直接研究，必要時采用病理學(xué)手段客觀描繪促滲結(jié)果，將中醫(yī)藥推向國際化更進(jìn)一步。