食物蛋白源生物活性肽的研究進展

胡子聰，于阿立，劉香云，周靈蝶，王進勝，房翠蘭*

1. 中糧東海糧油工業（張家港）有限公司（張家港 215634）；2. 重慶市九龍坡區疾病預防控制中心（重慶 400039）

生物活性肽是一類對生命有機體具有重要生理功能的肽類功能分子，它是利用酶、微生物、酸和堿等使蛋白質水解得到的由2個或2個以上氨基酸殘基組成、分子量小于6 kDa的具有特殊活性的肽類[1]，并且由于其促進健康的特性而對人類產生積極作用，如抗高血壓、抗血栓、抗氧化、降膽固醇、調節免疫等[2]。研究發現多種生物活性肽，一方面它們存在于谷物類、豆物類、乳源性和水生生物的蛋白質中，另一方面是由這些食物原料經加工處理后產生，在特定食品加工過程中，如乳制品、釀酒及腌肉制品的發酵過程中，產生大量生物活性肽[3-4]。因此在查閱大量文獻資料的基礎上，對生物活性肽的制備方法和生理功能展開綜述。

1 生物活性肽的制備方法

生物活性肽具有顯著的生物活性，在食品和醫藥領域具有廣泛的應用前景，市場上對生物活性肽的需求量也逐漸增加，因此制備活性高、產量高的生物活性肽是當前研究的熱點，生物活性肽的制備方法主要包括酶解法、輔助法、發酵法。

1.1 酶解法

酶解法（EH）即利用蛋白酶催化作用蛋白質生成氨基酸和多肽的過程，木瓜蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和肌動蛋白酶是常用的酶。該法被廣泛用于制備生物活性肽，其優點在于工藝流程簡單、提取速度快、酶解條件容易控制，制備的生物活性肽性能比較穩定，在酸性條件和較高溫度條件下結構保持完整。此外酶解法利用特定的蛋白酶類，可以有目的地對特定肽段進行剪切，以期獲得所需功能活性的肽[5]。表1列舉了采用酶解法對不同蛋白質原料制備生物活性肽，可以明顯看出來自食品加工副產品的大多數蛋白質構成獲得富集的生物活性肽級分的底物，這樣就能減少副產物對環境所造成的污染，提高產品的附加值。通過這些食物蛋白質水解產生的生物活性肽，表現出廣泛的生物學特性，如降血壓、抗氧化等。

表1 不同原料酶解法制備活性肽

然而，由于食物和副產物基質結構的復雜性，酶與底物相互作用的程度有限，所需酶解時間長，難以實現最佳酶解效果和原料的最大化利用，并且易產生次級代謝產物，如苦味肽等[6]。因此近年來大量的研究工作集中在開發一種高效和工業上可行的工藝和預處理方法（如高壓靜水壓力輔助酶解法等），以提高水解效率。

1.2 高靜水壓輔助酶解法

高靜水壓（HHP）法最早用于消滅牛奶中的微生物，近年來該方法作為一種非熱加工技術，被廣泛用于規模化的食品預處理工藝中。由于HHP法通過加壓（100～1 000 MPa）誘導單體、寡聚體和聚集物的形成，無需添加化學試劑或使用高溫，對二硫鍵和肽鍵等共價鍵幾乎沒有影響[15]，蛋白質的一級結構沒有被改變，并且對食品營養成分、風味物質沒有影響，能最大限度地保持食品原有的風味和營養。

采用HHP處理食品蛋白時，加壓可能導致蛋白質分子結構展開，暴露出蛋白酶的靶點，提高酶水解的敏感性（如圖1所示）。若在酶水解的同時或酶解之前，用HHP對食物蛋白進行預處理，可以更高效地獲取蛋白質來源的生物活性肽。Boukil等[16]利用胰蛋白酶水解牛乳清蛋白（β-LG）生產活性肽，結果發現在胰蛋白酶水解前，在400 MPa下對β-LG預加壓處理10 min可以改善肽譜，提高肽產率和生物活性肽的生成。HHP除了提高酶對蛋白質的水解效率外，還能改善產物肽的活性。Zhou等[17]在研究HHP和EH對銀杏籽蛋白（GSPs）水解和致敏性的影響時發現，木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶在壓力300 MPa時表現出最高的GSPs水解，所得產物肽的分子量均低于10 kDa，抗原性降低95%以上。

圖1 酶解法（EH）、高靜水壓（HHP）預處理后酶解法和高靜水壓酶解同時處理食物蛋白生產生物活性多肽的機理

1.3 發酵法

發酵法用于食品工業大規模生產發酵乳制品、豆類制品、魚肉制品的發酵劑和非發酵劑細菌（如黑曲霉、米曲霉、枯草芽孢桿菌、乳酸菌等，如表2所示），在生長代謝過程中產生的蛋白酶，將活性肽片段從底物蛋白中水解釋放出來，這是發酵法制備生物活性肽的基礎。與利用工業酶制劑水解生產活性肽相比，發酵法的主要優勢在于：發酵過程中底物蛋白既能作為菌種生長繁殖的營養物質，也是菌種分解的目標產物，這樣的結構體系可減少廢物排放，使資源得到充分利用；發酵過程中可對某些苦味肽基團進行修飾和重組，獲得的活性肽能達到基本無苦味，可以有效運用到保健食品領域；微生物傳代時間短，可以連續利用微生物代謝產生的復合酶系，釋放出更多的特定活性肽，生產效率較高。

在利用發酵法時，需選擇合適的菌種，控制最佳的發酵條件，如表2所示，利用不同菌種發酵，最佳的發酵條件存在差異。因此根據發酵工藝的差異，將發酵法分為固態發酵和液態發酵。在固態發酵中，選擇合適的菌種進行擴大培養，得到產量多、活性好、抗雜菌能力強的發酵基團。將經過預處理的原料與發酵基團充分混合均勻，進入發酵生產過程[18]。由于固態發酵屬于需氧發酵，發酵過程需要接觸外界空氣，容易受到雜菌的污染，因此根據不同菌種的生長繁殖特性，提供合適的營養條件，使目標菌體具有絕對的生長優勢，從而抑制雜菌生長。液態發酵利用真菌和細菌進行的混合發酵，能夠充分利用細菌和真菌的優勢，發酵過程中產生的蛋白酶活性強，酶系豐富，發酵速度更快，與固態發酵相比，液態發酵周期短、生產效率高、菌種生長狀況好，適合大規模工業化生產[19]。Torino等[20]研究扁豆液態發酵和固態發酵對生產具有抗氧化和抗高血壓性質的水溶性組分的影響，試驗結果顯示，液態發酵產生的功能性水溶性提取物含較多總酚和抗氧化物。

表2 不同原料發酵法制備活性肽

但微生物發酵法在制備生物活性肽也有一定的缺點，如很多的產酶菌本身有毒或分泌的產物對人體有害，發酵法的關鍵技術就是選擇合適的菌種，而已證明無毒、可用于食品研發的菌種并不多，安全問題、作用機理成為阻礙微生物發酵法制備活性肽的最大障礙。

1.4 其他方法

基因重組法合成生物活性肽就是在已知氨基酸和核酸序列的前提下，人工設計合成表達活性肽的基因，并將其與適當的載體重組，將其導入受體菌中進行誘導表達，獲得目的活性肽[29]。通過這種方法得到的肽產量和純度有很大提高，是大量獲得某特定生物活性肽的有效途徑之一。該法常用于新型活性肽的開發，在生物醫藥領域應用廣闊。王東波等[30]利用基因重組技術高效制備具有促進角膜上皮細胞增殖功能的垂體腺苷酸環化酶激活肽（PACAP 27）衍生多肽RP2，結果表明，RP2純度達96%，可有效促進角膜上皮細胞的增殖，從而有望成為一種新型角膜損傷治療候選藥物。

2 生物活性肽的生理功能

2.1 抗氧化

生命有機體在生長發育、新陳代謝過程中，由于內部因素（細胞的吞噬作用、呼吸作用等）和外部因素（暴露于輻射、污染物中）作用，體內的氧化平衡會被打破，細胞穩態受到干擾，機體會受到一定程度的氧化應激損害，并誘發多種慢性病和急性病，如動脈粥樣硬化、癌癥、神經紊亂和糖尿病等[31]。

抗氧化肽一般由5～16個氨基酸殘基組成，并在N-末端包含疏水性氨基酸[32]，具有分子量小、結構簡單、穩定性好、安全高效等特點。從食物或食品加工副產物中制備的抗氧化肽能夠通過清除自由基而發揮抗氧化的作用。Mendis等[33]利用酶法制備鱈魚皮膚明膠水解物，并分離出一種序列為His-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Leu的活性肽，該肽對超氧化物、1, 1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH）的清除活性最高。Ohata等[34]在對發酵肉醬中抗氧化肽分離純化并研究其清除DPPH自由基和羥基自由基活性時發現，肉醬發酵過程中產生的三肽（Gln-Tyr-Pro）具有很強的DPPH自由基和羥基自由基清除活性，而這種高強度的抗氧化性可能與氨基酸序列中Tyr-Pro序列有關。

此外抗氧化肽還可以通過維持氧化還原平衡、提升抗氧化酶活性來降低細胞中氧化應激水平。Xu等[35]研究富硒大米蛋白酶解產物（SPHs-3）的活性時發現，用質量濃度100 μg/mL的SPHs-3處理由Pb2+暴露引起中毒的人肝癌細胞系（HepG-2）中PC12細胞和RAW264.7細胞，會使這些細胞的活力提升24.9%和23.0%，同時也會增強SOD活性和提高GSH含量，從而保護這2種細胞免受Pb2+毒害。

2.2 降血壓

高血壓是與腦血管、心臟和腎臟并發癥緊密聯系在一起的疾病。人體的血壓和血管張力是由血管緊張素轉換酶（ACE）對腎素-血管緊張素系統和激肽釋放酶-激肽系統進行調節。從腎臟釋放的腎素將血管緊張素原轉化為ACE-I，ACE能將ACE-I水解為ACEII，使血管進一步收縮，導致動脈血壓在中長期內增強，因此抑制ACE活性對降血壓和治療心血管疾病治療具有顯著作用[36]。

雖然利用化學方法合成的ACE抑制劑用于臨床治療已逾30年，且效果顯著，但長期使用會造成干咳和血管神經性水腫[37]。天然的ACE抑制肽是預防和治療高血壓的一種有希望的替代藥品。Kim等[38]以玉米麩質為原料，經淀粉消化和熱變性處理后，用6種工業蛋白酶對其進行水解，得到具有ACE抑制活性的肽。蛋白質酶促水解得到的ACE抑制肽具有抗高血壓活性，Yang等[39]對玉米蛋白粉進行去除淀粉的預處理之后，通過堿性蛋白酶水解，使用凝膠過濾法從樣品的水解產物中分離出ACE抑制肽。應用氨基酸分析和HPLC-MS分析，確定該肽的氨基酸序列為Ala-Tyr，按50 mg/kg體重的劑量飼喂自發性高血壓大鼠，2 h后觀察到收縮壓最大降低9.5 mm Hg。

2.3 免疫調節

生物活性肽通過調節淋巴細胞增殖、某些細胞因子的產生和刺激巨噬細胞活性對機體產生免疫調節活性[40]。這類肽主要來源于牛奶、玉米、魚類等食品中蛋白質酶解或腸道消化[41]。由于分子量小、不具免疫原性，因此進入機體后不會誘發免疫排斥反應。Mercier等[42]通過研究乳清蛋白的酶消化物對小鼠脾臟淋巴細胞體外增殖的影響來評估它們的免疫調節特性，結果發現乳清蛋白通過胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶消化釋放免疫活性肽，當乳清蛋白分離物濃度100 mg/mL時能顯著增強淋巴細胞體外增殖。肽的理化特性，如荷點狀況、親疏水性、肽鏈長度、氨基酸組成等對其活性影響很大。Cian等[43]對一種紅色海藻進行酶解，其產物具有高的水解度，其組成中含有天冬氨酸、丙氨酸和谷氨酸，研究該產物在體外對原脾細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞產生的影響，結果發現這種酶解產物可促進大鼠的脾淋巴細胞增殖，降低TNF-α和其他促炎因子的產生，從而起到免疫調節作用。

2.4 其他生理功能

除了上述提到的生物活性作用之外，生物活性肽還能調節神經系統。從食物蛋白（牛奶酪蛋白、小麥面筋蛋白和血紅蛋白等）中衍生出來的外啡肽，具有穩定性好、副作用小的特點。這類多肽對阿片受體具有良好的親和力，對中樞神經系統及外周器官均起調節作用[44]。

如今營養過剩和肥胖所導致的2型糖尿病，是人類面臨的主要的健康問題。二肽基肽酶IV（DPPIV）是一種絲氨酸蛋白酶，能夠優先從不同底物的N末端切割X-脯氨酸或X-丙氨酸二肽，其抑制作用會降低其對胰高血糖素樣肽（GLP-1）和葡萄糖依賴性促胰島素肽（GIP）的作用，保持較低的GLP-1降解，從而達到降低血糖的作用[45]。研究發現從魚類、海鮮、牛奶或肉類的水解產物制備的生物活性肽能夠抑制DPPIV的活性，達到控制2型糖尿病的目的[46]。

3 結語

來源于食物蛋白中的生物活性肽，具有生理功能多樣、安全性高、價格低廉、特異性強等優點，受到食品、醫藥領域的研究與關注。我國擁有大量豐富的蛋白質資源，在食品工業中，大量原料利用率不高，農副產品加工中產生的大量下腳料和工業廢物中含有大量蛋白質。采用合適、高效的策略進行蛋白質的精深加工，制備生物活性肽，既可節約資源又能保護環境。未來生物活性肽的研究側重于提高制備技術水平、延長食源性生物活性肽的保存時間及提高其穩定性等方面。