禽網狀內皮組織增生癥病毒單抗制備及在外源病毒檢測中的應用

陳曉春，趙 煒，蘇 佳，王 嘉，侯力丹，黃小潔，吳華偉，李俊平

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

禽網狀內皮組織增生癥(Reticuloendotheliosis，RE)是指由反轉錄病毒科網狀內皮組織增生癥病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)群引起的幾種禽類的一群病理綜合征，主要包括矮小綜合征、淋巴組織及其他組織形成的慢性腫瘤、急性網狀細胞腫瘤等[1]，能引起嚴重的免疫抑制。該病在禽群中普遍存在，而且一旦種禽感染，可通過垂直傳播迅速波及整個群體。疫苗中污染REV被認為是近些年引起RE傳播和流行的主要途徑，報道最多的是被REV污染的禽痘疫苗和馬立克氏病疫苗使用后引起的嚴重經濟損失[2-3]，其次是禽成髓細胞性白血病病毒作為反轉錄酶的來源而廣泛用于生化研究，其種毒含有低水平的REV[4]。2004年，丁家波等利用間接免疫熒光法(Indirect immunofluorescence assay, IFA)、PCR和核酸雜交等方法，對國內多家企業生產的禽痘病毒疫苗和禽痘病毒(Fowl pox virus, FPV)臨床分離株進行了REV污染和基因整合情況研究，發現所有疫苗樣品的FPV基因組和臨床分離株中均檢出REV核酸陽性或病毒陽性，這是我國首次關于FPV基因組中整合進REV基因組成分的報道[5]。2005-2009年，李俊平等對203批次禽用活疫苗采用IFA法進行REV污染檢測，結果檢出雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗和雞痘活疫苗(鵪鶉化弱毒)2個品種共8個批次呈陽性(3.9%)[4]。

目前，我國已強制要求獸用活疫苗生產必須使用SPF雞胚，徹底杜絕用非免疫雞胚制備活疫苗，在一定程度上保證了禽用疫苗的質量和養禽業的健康發展。《歐洲藥典》和《英國藥典(獸藥)》只對生產禽源疫苗的種毒和生產原材料(主要是SPF雞胚)進行REV污染的檢測，對成品中是否污染REV沒有要求檢測。《日本農林水產省獸醫生物制品標準》要求對成品進行REV污染檢測。我國從2010年版《中國獸藥典》開始將REV和禽白血病病毒(Avian leukosis virus, ALV)的檢測列入禽外源病毒檢測必檢項目[3]。REV檢測采用IFA方法進行，使用的一抗為SPF雞制備的多克隆抗體，染色效果良好。但制備多克隆抗體過程繁瑣、周期長、成本高，而且多克隆抗體本身的特異性也有待提高。為降低制備成本，進一步提高檢驗的特異性，本研究制備了針對REV主要囊膜蛋白gp90的單克隆抗體，并建立了基于單抗的IFA方法，用于外源性REV檢驗。

1 材 料

1.1 細胞與動物 SP2/0骨髓瘤細胞、BALB/c小鼠等單克隆抗體制備用材料均由北京六合華大蛋白研發中心有限公司提供。雞胚成纖維細胞(Chick embryo fibroblast, CEF)按照現行《中國獸藥典》附錄進行制備。

1.2 病毒

1.2.1 REV REV-T株由中國獸醫藥品監察所保存；CY 1111株(2011年，山東，蛋雞)[6]、SY 1209株(2012年，遼寧，蛋雞)[6]、HS/1412 R株(2014年，遼寧，蛋雞)[7]、HLJR 0901株(2009年，黑龍江，蛋雞)[8]，均由哈爾濱獸醫研究所提供；HA 1101株(2011，江蘇，蛋雞)[9]，由揚州大學教育部禽類預防醫學重點實驗室提供；IBD-C 1605株(2015，山東，REV污染疫苗)[10]、REV 161214株(2016，河北，蛋雞)、SDAUS-1株(2016，河北，公雞精液)，由山東農業大學家禽腫瘤病實驗室提供。

1.2.2 ALV ALV-A(RAV-1株)、ALV-B(RAV-2株)由中國獸醫藥品監察所保存；ALV-C(RAV-49)、ALV-J(HPRS-103)由哈爾濱獸醫研究所提供；ALV-K(SDAUAK 11株)[11]由山東農業大學家禽腫瘤病實驗室提供。

1.2.3 其他病毒 雞新城疫病毒(NDV)La Sota株、雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)B87株、火雞皰疹病毒(HVT)Fc126株、雞馬立克氏病毒活疫苗(MDV)CVI 988株、禽腺病毒I群(FAdV-I)YR36株,均由中國獸醫藥品監察所保存。

1.3 菌種、載體 表達載體pET-30a、表達菌BL21及蛋白表達與純化試劑均由北京六合華大蛋白研發中心有限公司提供。

1.4 其他試劑 FITC標記的抗小鼠IgG，sigma公司產品；新生牛血清，Hyclone公司產品；M199細胞培養液，Gibco公司產品。

2 方 法

2.1 免疫原的制備 根據GenBank上公布的REV序列，采用DNAStar軟件對SU蛋白進行二級結構、親疏水性、抗原性和功能區的分析，選取抗原表位相對集中的53～362 aa蛋白序列作為目的片段。對該區域的核苷酸片段(1098 bp)進行合成，并在5′和3′端加入EcoRⅠ和XhoI酶切位點，用于載體的克隆。序列合成在北京六合華大蛋白研發中心有限公司進行。

用限制性內切酶EcoRⅠ和XhoI分別對合成的序列和質粒pET-30a進行雙酶切，將純化回收的片段和表達載體酶切產物用DNA Ligation Kit連接后轉化至感受態細胞(BL21)。挑取單克隆菌株培養，經PCR鑒定后，用IPTG(0.5 mmol/L)16 ℃誘導過夜，離心收獲菌體，超聲破菌(500 W，180次，每次5 s，間隔5 s)。通過鎳柱純化，經SDS-PAGE電泳檢測純度在85 %以上時，作為單抗的免疫原。

2.2 單克隆抗體的制備與鑒定 用上述純化蛋白按每只小鼠30 μg～60 μg的劑量，多次皮下注射4只BALB/c雌性小鼠。采用間接ELISA檢測小鼠抗體效價，對血清效價較高的小鼠，用免疫原50 μg進行腹腔注射免疫沖擊一次，免疫后3日，按常規方法進行細胞融合。將上述融合細胞培養物經SU蛋白包被的ELISA板進行兩次篩選，挑選ELISA陽性的雜交瘤細胞株上清采用IFA方法篩選與REV全病毒具有良好反應性的細胞株。然后選取免疫熒光檢測為陽性的細胞株采用有限稀釋法進行亞克隆，直至細胞克隆抗體陽性率達100 %，擴大培養后液氮中保存。對篩選出的雜交瘤細胞株分別進行亞型鑒定、細胞穩定性檢測、無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗。

2.3 腹水的制備 經鑒定合格后，制備小鼠腹水。取9周齡BALB/c小鼠10只，腹腔注射降植烷，每只0.5 mL。7～10 d后每只小鼠腹腔注射雜交瘤細胞1×106～1×107/0.5mL，7～10 d后觀察小鼠狀態，待小鼠腹部明顯膨大、行動不便時，抽取小鼠腹水，3000 r/min離心10 min，取上清，-40 ℃保存。間隔2～3 d，若腹水再次產生，可再次采集。

2.4 效價測定 將REV-T株病毒液用含2%新生牛血清的M199培養液稀釋成100 TCID50/0.1mL，接種已長成良好CEF單層的96孔板，100 μL/孔。然后置37 ℃、含5% CO2的溫箱中培養5 d，冷甲醇固定。將腹水進行1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600、1∶51200、1∶102400稀釋，測定效價。

2.5 特異性試驗 對接種了ALV(RAV-1株和RAV-2株)、NDV(La Sota株)、IBDV(B87株)、FAdV-I(YR36株)、HVT(Fc126株)、MDV(CVI 988株)等病原(毒株信息見1.2項)的帶毒細胞進行檢測，觀察是否出現特異性熒光，以確定該單抗的特異性。

2.6 單抗反應性協作標定 委托中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所、山東農業大學家禽腫瘤病實驗室、揚州大學教育部禽類預防醫學重點實驗室對該單抗進行不同REV毒株反應性和不同亞型ALV毒株反應性驗證試驗。毒株信息見1.2項。

2.7 IFA方法的建立

2.7.1 IFA試驗程序

2.7.1.1 病毒感染細胞板的制備 將陽性病毒用含2%新生牛血清的M199培養液稀釋成100 TCID50/0.1mL，接種已長成良好CEF單層的96孔板，100 μL/孔。然后置37 ℃、含5% CO2的溫箱中培養5 d，進行間接免疫熒光染色。

2.7.1.2 固定 采用冷甲醇固定細胞板，自然晾干，2～8 ℃保存備用。

2.7.1.3 加一抗(單克隆抗體) 將待檢的單克隆抗體用PBS稀釋適宜倍數，加入REV感染細胞板中，37 ℃孵育。

2.7.1.4 洗滌 棄去板孔中的一抗，用PBS洗滌并輕微振蕩洗滌。

2.7.1.5 熒光二抗染色 盡量棄盡洗液，每孔加入用PBS作適當稀釋的熒光標記的羊抗小鼠IgG，37 ℃避光孵育。

2.7.1.6 洗滌 方法同2.7.1.4項。

2.7.1.7 觀察 在倒置熒光顯微鏡下用藍色激發光(波長490 nm)觀察。被感染的CEF細胞呈現綠色熒光，有完整的細胞形態，周圍未感染細胞不著色，視野發暗。

2.7.1.8 結果判定 正常細胞對照背景最暗且無特異性熒光。根據熒光強弱，其結果可判為-(無特異性熒光，背景純凈)、+(1個視野內有1個左右的特異性熒光)、++(1個視野內有1～10個特異性熒光)、+++(1個視野內有10個以上特異性熒光)。

利用小型榨油機榨取油脂，其出油率在21.1%～24.6%，其中三層模式的出油率平均最高，達到23.5%，此時毛葉山桐子油料最終含水量在8%，這與其他油料作物（如油菜）安全水分相近[12]。榨取的毛油酸價和過氧化值分別在 3.1～3.4 mg/g，2.1～2.9 mmol/kg，并且各處理各干燥層數值無顯著差異（p＞0.05），均低于國家對菜籽、油茶籽等毛油的品質標準規定，優于崔艷南等人[13]研究的未處理的工廠化毛葉山桐子毛油品質，這與干燥前處理與設備均有關系。

2.7.2 IFA試驗最適工作條件的確定

2.7.2.1 一抗工作濃度的確定 按照2.7.1項程序，以REV單克隆抗體作為一抗，工作濃度設1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400稀釋度，以呈現“+++”熒光強度的最大稀釋倍數作為一抗的最適工作濃度。

2.7.2.2 二抗工作濃度的確定 以上述確定的反應條件，將二抗分別作1∶100、1∶200、1∶400稀釋，進行IFA反應，以呈現“+++”熒光強度的最大稀釋倍數作為二抗的最適工作濃度。

2.7.2.3 一抗作用時間的確定 以上述確定的反應條件，分別以30 min、45 min、60 min作為一抗作用時間，進行IFA反應，觀察比較一抗作用時間對試驗結果的影響，確定一抗最適作用時間。

2.7.2.4 二抗作用時間的確定 以上述確定的反應條件，分別以30 min、45 min、60 min作為二抗作用時間，進行IFA反應，觀察比較二抗作用時間對試驗結果的影響，確定二抗最適作用時間。

2.8 人工感染試驗 取雞傳染性支氣管炎活疫苗(H120株)、雞新城疫病毒活疫苗(La Sota株)和雞馬立克氏病活疫苗(CVI 988株)三種疫苗各1批，樣品處理前每500羽份分別加入含50 TCID50、10 TCID50、5 TCID50、1 TCID50的REV-T株陽性病毒，同時設定未添加REV的疫苗對照組，按照《中國獸藥典》2015年版三部附錄3304進行樣品處理、接種和傳代培養，采用上述建立的IFA方法進行熒光染色，確定該方法最小檢出限。同時采用REV多克隆抗體進行比較和驗證。

3 結果與分析

3.1 重組SU蛋白的表達 重組菌經誘導表達后，超聲破菌，離心，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE檢測。結果在沉淀中檢測到大量的目的蛋白，說明該重組蛋白表達形式為包涵體表達(圖1)。

M：Marker；1：超聲后上清； 2：超聲后沉淀M：Marker; 1：Supernatant after ultrasound； 2：Precipitation after ultrasound圖1 REV-SU蛋白可溶性分析Fig 1 Solubility analysis of REV-SU protein

3.2 重組SU蛋白的純化與鑒定 純化后的蛋白進行SDS-PAGE電泳，以BSA為標準，通過SDS-PAGE凝膠掃描分析估計蛋白濃度為0.5 mg/mL，純度為85%。SDS-PAGE結果顯示在約46 kD處有明顯蛋白條帶(圖2)。

M：Marker；1：蛋白原樣；2：流穿；3： 15 mmol/L 咪唑洗脫；4： 60 mmol/L咪唑洗脫；5： 500 mmol/L 咪唑洗脫；6： 0.5 mg/mL BSAM：Marker; 1：Original protein; 2：Flow through; 3：Eluted by 15 mmol/L imidazole; 4：Eluted by 60 mmol/L imidazole; 5：Eluted by 500 mmol/L imidazole; 6： 0.5 mg/mL BSA圖2 REV-SU蛋白純化SDS-PAGE圖Fig 2 SDS-PAGE of purified REV-SU protein

3.3 雜交瘤細胞的篩選 采用REV-T株對ELISA陽性的雜交瘤細胞進行IFA篩選，結果篩選出1株與病毒產生特異性熒光的雜交瘤細胞，命名為Mab-SU-2A2株。結果見圖3。

3.4 雜交瘤細胞的鑒定結果 純凈性檢驗結果表明，雜交瘤細胞株Mab-SU-2A2株無菌生長，無支原體生長，無外源病毒污染，純凈性良好；該細胞株亞型為IgG2a亞型；連續培養10代，培養上清IFA效價均在1∶10～1∶20，穩定性好。

3.5 腹水效價測定 大量制備小鼠腹水，用IFA方法測定抗體效價，結果表明，Mab-SU-2A2株單抗腹水稀釋至1∶51200時，細胞仍可見特異性綠色熒光(圖4)，IFA效價為1∶51200。

圖4 單抗2A2腹水效價測定結果Fig 4 Determination of IFA titer of Mab 2A2 ascites

3.6 特異性試驗 對接種了ALV(RAV-1株和RAV-2株)、NDV(La Sota株)、IBDV(B87株)、FAdV-I(YR36株)、HVT(Fc126株)、MDV(CVI 988株)病原的帶毒細胞進行REV單抗熒光染色，均未檢測到特異性熒光，說明該單抗特異性良好。

3.7 協作標定結果 三家實驗室協作標定結果顯示，Mab-SU-2A2株單克隆抗體對于不同的REV毒株具有良好的反應性，分離株分別分離自山東、遼寧、黑龍江、吉林、河北等地，分離年份從2011年至2016年，樣品來源包括蛋雞、公雞精液及受污染的IBDV疫苗(圖5)；與分離自不同年份的A、B、C、J、K等亞群的ALV毒株均無交叉反應(圖6)，特異性良好。

圖5 單抗2A2與不同REV毒株反應性結果Fig 5 Reaction between Mab-Su-2A2 with different REV strains

圖6 單抗2A2與不同ALV毒株反應性結果Fig 6 Reaction between Mab-Su-2A2 with different ALV strains

3.8 IFA方法條件優化 經優化，確定IFA最適反應條件為：一抗1∶800稀釋，作用時間60 min；二抗1∶200稀釋，作用時間60 min。

3.9 人工感染試驗 結果表明，采用REV單克隆抗體作為一抗對污染了不同劑量REV的雞傳染性支氣管炎活疫苗(H120株)、雞新城疫病毒活疫苗(La Sota株)和雞馬立克氏病活疫苗(CVI 988株)三種疫苗進行檢測的最低檢出量分別為5 TCID50、5 TCID50、10 TCID50，與雞抗REV多克隆抗體作為一抗進行熒光染色結果相當(分別為5 TCID50、10 TCID50、10 TCID50)，且背景更加純凈(圖7)。

A：10 TCID50污染組REV單抗染色；B：疫苗對照組REV單抗染色；C：10 TCID50污染組REV多克隆抗體染色；D：疫苗對照組REV多克隆抗體染色A：Stained with REV Mab in 10 TCID50 contaminated group; B：Stained with REV Mab in negative control; C：Stained with REV Pab in 10 TCID50 contaminated group; D：Stained with REV Pab in negative control圖7 活疫苗中人工感染REV的IFA檢測Fig 7 IFA detection of artificial-infected REV in live vaccine

4 討論與結論

REV感染可引起雞群生產性能下降和免疫功能低下，一旦疫苗污染REV，可對養殖業造成巨大經濟損失[1]。因此對禽用活疫苗進行REV污染檢測是確保疫苗產品質量和嚴格控制REV的重要手段。《中國獸藥典》2010年版三部收錄了外源性REV檢驗方法[12],該方法的頒布實施對禽用生物制品的質量控制起到了至關重要的作用。2021年，李雪蓮隨機抽取4種市售活疫苗，利用RT-PCR法、《中國獸藥典》IFA檢測法和SPF雞檢查法檢測活疫苗中的REV污染，比較三種檢測方法的優劣。結果表明，RT-PCR法方便、快捷，但會出現假陽性；SPF雞檢查法結果可靠，但周期較長，成本高；IFA檢測法與傳統雞檢查法相比具有快速、準確、成本低的優點，便于臨床推廣應用[13]。《中國獸藥典》2010年版和2015年版中該方法采用REV多克隆抗體作為熒光染色的一抗，在實施過程中發現，受細胞狀態、接種樣品品種等因素的影響，偶爾會出現檢測背景不清的現象。

gp90蛋白是一種膜表面糖蛋白，在不同時期和地域的REV分離株基因組中其氨基酸同源性超過95%[14]，保守性好，常被作為REV檢測和禽病毒性淋巴瘤(MDV和ALV)鑒別診斷的一個重要靶標蛋白[15-16]。因此本研究將REV囊膜蛋白gp90(SU)作為免疫原制備了單克隆抗體。該單抗與不同REV毒株均具有良好的反應性，且與不同ALV毒株和常見禽源病毒均沒有交叉反應，特異性良好。采用該單克隆抗體建立的IFA方法可檢出至少5 TCID50的REV感染，與多克隆抗體作為檢測一抗具有同等效力，且檢測背景更加純凈清晰。該成果已被《中國獸藥典》2020年版三部收錄[17]，用于禽用生物制品及原材料中外源性REV的檢測，為有效控制我國禽用活疫苗質量、完善國家標準和動物疫病防控提供了技術支持。

致謝：感謝哈爾濱獸醫研究所高玉龍研究員、揚州大學錢琨博士、山東農業大學趙鵬教授對本文給予的大力支持和幫助！